自然發(fā)酵腐乳中芽孢桿菌的分離與鑒定

劉 陽，鄒 偉，左上春，李玉斌，趙興秀

（四川理工學(xué)院，生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

自然發(fā)酵腐乳中芽孢桿菌的分離與鑒定

劉 陽，鄒 偉*，左上春，李玉斌，趙興秀

（四川理工學(xué)院，生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

從自然發(fā)酵腐乳中篩選芽孢桿菌并研究其作用。根據(jù)菌株產(chǎn)蛋白酶能力大小，對自然發(fā)酵腐乳中細菌進行分離純化獲得四株芽孢桿菌，經(jīng)純化培養(yǎng)后觀察其個體形態(tài)和菌落形態(tài)，利用Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)和16S rDNA序列分析對其精確鑒定。結(jié)果顯示四株菌株分別為：一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis B），兩株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus B），一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens B）。

腐乳，芽孢桿菌，Biolog微生物鑒定，16S rDNA序列分析

腐乳是我國傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品，是由微生物固態(tài)發(fā)酵豆腐，經(jīng)鹽水和酒后熟而制得，其風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富、價格低廉，已受到國內(nèi)外食品和營養(yǎng)學(xué)者的廣泛關(guān)注。根據(jù)加工方法的不同可以將腐乳分為：自然發(fā)酵腐乳、霉菌發(fā)酵腐乳、細菌發(fā)酵腐乳和酶法腐乳。腐乳制作工藝大致相同，只是自然發(fā)酵腐乳是在空氣中自然接種，而其他腐乳是通過人工接種經(jīng)純培養(yǎng)的霉菌、細菌等發(fā)酵而成[1-2]。目前家庭自制腐乳一般是在適宜的溫度下，自然接種空氣中霉菌產(chǎn)生的孢子發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，除優(yōu)勢菌群——霉菌發(fā)揮主要作用以外，芽孢桿菌的重要性也不能忽視，因此，對腐乳中的芽孢桿菌進行分離鑒定，進一步可深入探討其在腐乳發(fā)酵中發(fā)揮的作用。

芽孢桿菌是一類好氧微生物，具有抗逆性強、營養(yǎng)需求低、復(fù)活率高、生長速度快等特點，并可產(chǎn)多種酶類、能有效抑制病原菌生長，被視為最理想的益生菌類之一，常作為動物微生態(tài)制劑生產(chǎn)菌種[3-6]。目前，芽孢桿菌應(yīng)用非常廣泛。丁祥力等的研究表明，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，枯草芽孢桿菌能夠顯著去除亞硝酸鹽、硫化物等，有效改善淡水養(yǎng)殖水體的水質(zhì)[7]；李小剛等在研究巨大芽孢桿菌對蛋雞生產(chǎn)性能、養(yǎng)分消化率及血清指標(biāo)的影響時發(fā)現(xiàn)，巨大芽孢桿菌1259能夠顯著提高其谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性和鈣、磷含量[8]；錢英等對解淀粉芽孢桿菌的抑真菌作用進行了研究，結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌BW-13發(fā)酵濾液對植物病原菌灰霉具有顯著的拮抗作用[9]。在腐乳的研究中，關(guān)于芽孢桿菌的報道很少，楊佐毅等[10]曾從白腐乳中分離出一株蠟狀芽孢桿菌，并闡述了該菌在腐乳中的生產(chǎn)與保藏中的食用安全性，而其他關(guān)于芽孢桿菌的研究報道則更少。

本實驗根據(jù)不同菌株產(chǎn)蛋白酶的能力強弱，從家庭自制的自然發(fā)酵腐乳中篩選出四株芽孢桿菌，并分析這四株菌在自然發(fā)酵腐乳過程中可能發(fā)揮的作用，為其在自然發(fā)酵腐乳的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用中奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腐乳 市售，四川自貢川南地區(qū)家庭自制發(fā)酵的紅腐乳和白腐乳；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 牛肉膏3 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH7.2～7.4，加熱融化后121℃滅菌20 min；平板分離培養(yǎng)基蛋白胨2.5 g/L，葡萄糖1 g/L，酵母膏1 g/L，干酪素10 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH7.2～7.4，加熱融化后121℃滅菌20 min；斜面培養(yǎng)基 蛋白胨5 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH7.2～7.4，加熱融化后121℃滅菌20 min。

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LG10-2.4A高速離心機 北京醫(yī)用離心機廠；TDL-5C型低速臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；868型pH計 上海熱電儀器有限公司；CX31-72C02型顯微鏡 日本NIKON公司；Gen III Microstation型Biolog菌種鑒定儀 美國biolog公司等；DY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；GelDoc 2000型凝膠成像系統(tǒng)、S1000型PCR擴增儀 美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體富集培養(yǎng) 稱取腐乳樣品1 g，加入99 mL帶玻璃珠的無菌水中，振蕩，制成10-2的菌懸液。吸取1mL 10-2的菌懸液于9 mL的無菌水中，制得10-3的菌懸液，依次制得10-4、10-5、10-6、10-7的菌懸液，分別取各個梯度的菌懸液0.2 mL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，置于35℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)1～2 d。觀察菌落的生長變化。每個稀釋度做3個平行。

1.2.2 菌體分離、純化 將上述富集培養(yǎng)后的菌落劃線轉(zhuǎn)接于酪蛋白平板分離培養(yǎng)基上，置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，觀察產(chǎn)生透明圈的情況。挑取產(chǎn)透明圈較大的菌落以分區(qū)劃線的方式接入酪蛋白培養(yǎng)基中。置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，觀察產(chǎn)生透明圈的情況。再次挑取單個透明圈與菌落直徑比值大的菌落以平板分區(qū)劃線的方式接種于酪蛋白培養(yǎng)基上，進行菌種的純化。如此反復(fù)純化5次后，鏡檢觀察是否得到了純菌落。

1.2.3 菌種鑒定 通過革蘭氏染色確定所分離到的菌株是G-或G＋，在顯微鏡下觀察其菌體形狀及是否產(chǎn)芽孢，并通過Biolog菌種鑒定和16S rDNA序列分析進一步分析鑒定各菌株。

1.2.3.1 Biolog菌種鑒定 Biolog鑒定原理[11]：利用微生物對不同碳源代謝率的差異，針對微生物在利用碳源過程中產(chǎn)生的自由電子與四唑鹽染料發(fā)生還原顯色反應(yīng)（顏色的深淺程度可以反映微生物對不同碳源的利用程度），以及由于微生物生長造成的濁度差異，與標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)據(jù)庫進行對比，即可得出最終鑒定結(jié)果。每種結(jié)果顯示3個參數(shù)，即可能性（PROB），相似性（SIM）和位距（DIS）。SIM表示測定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)數(shù)據(jù)條的相似程度，DIS表示測定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫相應(yīng)數(shù)據(jù)條的位距。如果鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫匹配良好，狀態(tài)欄為綠色，若鑒定結(jié)果不可靠，狀態(tài)欄為黃色，并顯示“NO ID”字樣，但仍會列出最可能的10種結(jié)果。

Biolog系統(tǒng)規(guī)定：細菌培養(yǎng)4～6 h，其SIM值≥0.75，培養(yǎng)16～24 h時，SIM值≥0.50，系統(tǒng)自動給出的鑒定結(jié)果為種名，SIM值越接近1.00，鑒定結(jié)果的可靠性越高；當(dāng)SIM值小于0.5，但鑒定結(jié)果中屬名相同的結(jié)果的SIM值之和大于0.5時，自動給出的鑒定結(jié)果為屬名。

1.2.3.2 16S rDNA序列分析 采用細菌通用擴增引物，即27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’和1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’，以菌種基因組為模板進行PCR擴增。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性60 s，50℃退火60 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。利用膠回收PCR擴增產(chǎn)物，送華大基因科技股份有限公司測序。在NCBI網(wǎng)站中使用Blastn功能將測序得到的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知標(biāo)準(zhǔn)菌16S rDNA序列進行同源性比對分析，進一步準(zhǔn)確鑒定菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離篩選

菌樣在牛肉膏蛋白胨平板上富集培養(yǎng)的結(jié)果如圖1。轉(zhuǎn)接到酪蛋白分離平板上后，其產(chǎn)生酪蛋白水解圈如圖2。根據(jù)不同時間內(nèi)對酪蛋白水解圈的直徑（D）與菌落直徑（d）的比值的大小的測定，選出4株比值較大的菌株，分別編號為：A1、A2、A3、B2，其透明圈直徑與菌落直徑的比值分別為4∶1、5∶1、3∶1、4∶1。將4株菌進行進一步純化，得到純種菌株，進而后續(xù)實驗。

圖1 菌種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的生長Fig.1 Growth of strains in beef extract peptone medium

圖2 分離菌在酪蛋白平板上產(chǎn)生的水解圈Fig.2 Hydrolysis circle of isolated bacteria in casein medium

2.2 菌種的鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)、個體形態(tài)的觀察 培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)，A1菌落大而扁平，呈乳白色，中間厚邊緣薄，不透明，干枯；A2菌落大而扁平，乳白色，不透明，邊緣不是很整齊，干枯；A3菌落扁平，中間厚邊緣薄，且中間呈乳白色，邊緣較透明。B2菌落與A1相似，較A1小。通過顯微鏡觀察得出，A1、A2、A3、B2均有芽孢，且都是短桿菌，經(jīng)革蘭氏染色后得到四株菌均為G＋菌。

2.2.2 Biolog微生物自動分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果 利用Biolog菌種鑒定儀對分離到的4株菌進行鑒定，分別在4～6 h及16～24 h內(nèi)各進行了數(shù)據(jù)的讀取，結(jié)果見表1。一般16～24 h的結(jié)果較為穩(wěn)定，從表2中可以看出，A1菌SIM值=0.62＞0.5，DIS=3.45＜5.0，PROB=96%，所以可以確定A1為Bacillus cereus B；A2菌SIM值= 0.46＜0.5，DIS=8.32＞5.0，沒有PROB值，但結(jié)果給出了可能相似的10株數(shù)據(jù)庫內(nèi)的菌種，其中1號菌為Bacillus subtilis B，出現(xiàn)這種結(jié)果的可能原因有很多，其一可能是操作失誤，其二可能是該菌種不在數(shù)據(jù)庫中；A3菌SIM值=0.53＞0.5，DIS=4.96＜5.0，PROB= 90%，所以可以確定A3為Bacillus cereus B；B2菌SIM值=0.58＞0.5，DIS=4.32＜5.0，PROB=98%，所以可以確定B2為Bacillus amyloliquefaciens B。

2.2.3 16S rDNA序列分析結(jié)果 為了進一步的確定A2菌是否為枯草芽孢桿菌，又利用16S rDNA序列分析對其進行鑒定。將A2菌16S rDNA序列（如表2）與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列做相似性分析，結(jié)果表明，A2菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株FJ435215.1的同源相似性達到99%。挑選Blast比對后的部分序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。結(jié)果顯示A2菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株FJ435215.1聚在同一枝上，說明他們的親緣關(guān)系最近，可確定A2為 Bacillus subtilis。

圖3 A2菌的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain A2

表1 Biolog菌種鑒定結(jié)果Table 1 Result of identification of microorganisms by Biolog

表2 A2菌株16S rDNA測序結(jié)果Table 2 The sequencing result of 16S rDNA of the strain A2

3 結(jié)論與討論

本實驗從自然發(fā)酵的腐乳中篩選出四株芽孢桿菌，利用Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)、16S rDNA序列分析，最終得到一株枯草芽孢桿菌、兩株蠟樣芽孢桿菌、一株解淀粉芽孢桿菌。這三種菌在腐乳自然發(fā)酵過程中可能起著重要作用：枯草芽孢桿菌自身能夠合成淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和多種維生素B族，因此在協(xié)助霉菌分解蛋白質(zhì)同時，還能夠增加腐乳營養(yǎng)價值[12]；蠟樣芽孢桿菌是抗生素抗菌活性的測定菌，能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，抑制有害微生物繁殖，還可以產(chǎn)生蛋白酶，但是又會引起食物中毒，因此控制腐乳中蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量是食品安全的重要保證[13]；解淀粉芽孢桿菌能夠廣泛地抑制真菌和細菌活性，具有很強的次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力，因此可能對腐乳中雜菌的抑制和多種有機活性成分的產(chǎn)生起到一定的作用[14]。

綜上，在自然發(fā)酵腐乳中得到的四株芽孢桿菌具有安全可靠的食源性，下一步實驗應(yīng)進一步研究其在自然發(fā)酵腐乳過程中的作用，以便為其在自然發(fā)酵腐乳的大規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Isolation and identification of Bacillus in the natural fermentation of sufu

LIU Yang，ZOU Wei*，ZUO Shang-chun，LI Yu-bin，ZHAO Xing-xiu
（College of Bioengineering，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，China）

To screen the bacillus in the natural fermented sufu and study its function，according to the ability of protease production，bacteria in the naturally fermented bean curd were isolated and purified.Totally，four Bacillus were obtained.Then，those four stains were identified via a combination of individual shape and colony morphology observation，Biolog Microbial Identification System，and 16S rDNA sequence analysis.The four strains were identified as：one Bacillus subtilis B，two Bacillus cereus B，and one Bacillus amyloliquefaciens B，respectively.

sufu；Bacillus；Biolog microorganisms identification system；16S rDNA sequence analysis

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0213-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.036

2015－03－31

劉陽（1990-），男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：yangliuy521l@163.com。

*通訊作者：鄒偉（1985-），男，博士，講師，研究方向：食品發(fā)酵技術(shù)，E-mail：gubai1985@gmail.com。

四川理工學(xué)院校級項目（2013RC12）；四川理工學(xué)院學(xué)科特色培養(yǎng)項目（2013TS15）。