芡種殼提取物抗氧化、抑菌活性及其組分分析

張 汆，陳志宏，何曉偉，于士軍，柏 鈺

（滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州239000）

芡種殼提取物抗氧化、抑菌活性及其組分分析

張 汆，陳志宏，何曉偉，于士軍，柏 鈺

（滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州239000）

為了解芡種殼提取物主要生理活性和化學組成，采用體外抗氧化分析方法分析了提取物的總還原力、清除NO2-和DPPH·活性以及抗脂質(zhì)過氧化性質(zhì)；采用微生物培養(yǎng)法對其抑菌活性進行了分析；采用高效液相色譜法對其主要組分進行了分析。結(jié)果表明4種芡種殼提取物中總酚含量很高（387.62～763.65 mg/g），并顯示出較強的總還原力、較強的DPPH·清除作用和脂質(zhì)過氧化抑制活性以及中等強度的NO2-清除活性。4種提取物對大腸桿菌O157、阪崎腸桿菌、單增李斯特菌等顯示較強的抑菌活性。高效液相色譜分析結(jié)果表明，提取物中含有蘆丁、沒食子酸、綠原酸和兒茶素等活性組分。芡種殼提取物具有很強的抗氧化活性和一定的抑菌活性，與其中豐富的多酚物質(zhì)密切相關(guān)，作為天然抗氧化劑具有一定開發(fā)潛力。

芡種殼提取物，抗氧化活性，抑菌活性，組分分析

芡實是睡蓮科（Nymphaeaceae）芡屬植物（Euryale Salisb.ex DC.）芡（Euryale ferox Salisb．）的種子，俗稱“雞頭果”。芡實是我國傳統(tǒng)的中藥原料和滋補食材，除具有“補腎、健脾、養(yǎng)胃”等傳統(tǒng)醫(yī)學理論功效外，還具有抗氧化[1-2]、修復心肌局部缺血[3]的功效。芡種殼約占其種子質(zhì)量的30%～40%，是芡米加工中的主要副產(chǎn)物，我國（2014）年產(chǎn)量在5000 t以上，目前尚未開發(fā)利用。

國內(nèi)外有關(guān)芡實的研究主要集中在營養(yǎng)組分分析[4-5]、生理活性[1-3，6-9]以及加工[10-11]等方面。鄧宇等[12]、王和才等[13]先后在芡果皮中檢測到豐富的鞣質(zhì)，張汆等在芡種仁[14]中也檢測到大量的植物多酚物質(zhì)，在其生理保健功能中可能發(fā)揮重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，芡種殼中含有非常豐富的多酚物質(zhì)[15]。多酚物質(zhì)是自然界僅次于纖維素和淀粉的第三大天然產(chǎn)物，單寧、黃酮、異黃酮、花青素等均屬于多酚物質(zhì)。此類物質(zhì)一般具有多種生理活性，性質(zhì)非常活躍，廣泛分布于各種食品材料中，如茶多酚、葡萄酒多酚、大豆異黃酮等。目前，國內(nèi)外對芡種殼中多酚物質(zhì)的組成和生理活性研究較少，孫文凱等[15]、Wu ChengYing等[16]先后對芡種殼提取物的體外抗氧化性質(zhì)和體內(nèi)抗氧化活性進行了分析，結(jié)果均顯示其提取物具有顯著的抗氧化活性，并從中鑒定出四種物質(zhì)：沒食子酸、5，7-dihydroxy-2-（3，4，5-trihydroxyphenyl）-chroman-4-one、5，7，4’-三羥基黃酮（5，7，4-trihydroxy flavanone）和醉魚草素E（buddlenol E）。Yuan Huaibo等[17]研究發(fā)現(xiàn)，芡種殼提取物中富含萜類化合物，可顯著降低因鏈脲霉素（Streptozotocin）導致的糖尿病小鼠的血糖和血脂。

本課題組前期的研究表明芡實種仁和種殼中含有非常豐富的多酚，芡種殼中尤其豐富（20%）[14-15]。已有的數(shù)篇文獻報道，在芡實的不同組織中也發(fā)現(xiàn)鞣制[12-13]、黃酮和醉魚草素[16]、萜類[17]等生理活性組分。說明芡實種子中發(fā)揮抗氧化性質(zhì)的物質(zhì)不止一種，其組成比較復雜，它們在芡實保健功能中也應(yīng)該發(fā)揮不同的作用。但是，目前有關(guān)芡實生理活性的報道多集中在抗氧化性質(zhì)分析，而對其組成和作用機理的報道很少。此外，芡種殼提取物作為食品添加劑的使用也少有報道。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，主要是針對芡種殼中的酚類物質(zhì)的抗氧化性質(zhì)、作為天然食品添加劑對食品中常見微生物的抑菌性質(zhì)及其酚類物質(zhì)組成進行分析，希望通過研究探討芡種殼提取物生理活性及其作用機理，為芡種殼資源的綜合利用提供初步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮芡實（Euryale ferox Salisb．） 安徽省滁州市當?shù)禺a(chǎn)，2010年10月采收后，在清水中洗干凈芡實種子，手工剪開其芡種殼，取出種仁；芡種殼 于40℃烘箱內(nèi)干燥后，粉碎（過60目篩網(wǎng)），裝入聚乙烯自封袋內(nèi)，于4℃冰箱內(nèi)貯藏備用；DPPH·（1，1-二苯基-2-苦肼基自由基） 純度＞97.0%，購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；高效液相色譜用甲醇、乙酸等試劑 均為色譜純；平板計數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基 購自北京陸橋公司；蘆丁、沒食子酸、綠原酸、兒茶素等標準品 購自中國藥品生物制品檢定所；乳酸鏈球菌素（Nisin） 購自浙江銀象生物工程有限公司；其他常規(guī)試劑 均為分析純，購自國藥集團上海試劑公司；實驗微生物：魏斯氏菌（Weissella）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、葡萄球菌（Staphylococcus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸桿菌（Escherichia coli）、大腸桿菌O157（Escherichia coli O157）、阪琦腸桿菌（Enterobacter sakazakii）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、腸炎沙門菌（Salmonella enterica）、鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、赤霉菌（Gibberella zeae）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢桿菌（Bcaillus megaterium de Bary）等15種微生物菌種由南京農(nóng)業(yè)大學教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點實驗室提供。

CP124S型分析天平 德國Sartorius公司；FW135型粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；L550型大容量離心機 湖南湘儀離心機有限公司；LGJ-10B型冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；RE-85Z型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州科工貿(mào)有限公司；DGX-9073BC-1型電熱鼓風干燥箱 上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；UV-2450PC型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波發(fā)生器 昆山市超聲波儀器有限公司；GKYS型無菌操作臺 蘇凈集團蘇州安泰公司；精密微量移液器 100～5000 μL，德國Eppendorf公司；WH-2型微型旋渦混合儀 上海滬西科學儀器公司；HVE-50型滅菌器 日本Hirayama公司；M2e型酶標儀 美國美谷分子儀器有限公司；e2695型高效液相色譜儀、2489型紫外-可見光檢測器 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取物制備 參照文獻[15，17]中的提取方法，并做部分修改。稱取芡種殼粉100 g左右于燒杯中，向燒杯中加入乙酸乙酯400 mL左右，攪拌均勻，用保鮮膜封口。放入超聲波發(fā)生器中，20℃下超聲浸提10 min。抽濾，濾渣用乙酸乙酯在連續(xù)浸提2次，合并濾液，減壓回收溶劑，用水洗出提取物，得芡種殼乙酸乙酯提取液。濾渣中加入無水乙醇，采用上述方法連續(xù)浸提3次，抽濾，合并濾液，減壓回收溶劑，得芡種殼乙醇提取液。濾渣再用50%乙醇水溶液繼續(xù)浸提，采用同樣方法得到芡種殼50%乙醇提取液。最后，濾渣用熱水（70～80℃）連續(xù)浸提3次，采用同樣方法得到芡種殼水提取液。將上述4中提取液真空冷凍干燥48 h，即分別得到4種提取物：芡種殼乙酸乙酯提取物（A）、乙醇提取物（B）、50%乙醇提取物（C）和水提取物（D）。所得4種提取物，裝入棕色瓶內(nèi)，-20℃低溫貯藏，備用。

根據(jù)所得提取物中總酚含量計算總酚提取率，根據(jù)所得提取物質(zhì)量與芡種殼質(zhì)量計算樣品得率。計算公式如下：

總酚提取率（%）=（提取物中總酚質(zhì)量/樣品中總酚質(zhì)量）×100

樣品得率（%）=（提取物質(zhì)量/芡種殼質(zhì)量）×100

1.2.2 提取物組分分析 總酚含量：采用Folin-Ciocalteus（FC）福林酚試劑法[18]測定，總糖含量：采用苯酚-硫酸法測定[19]。

1.2.3 抗氧化特性分析 將A、B、C和D四種提取物配制成10～50 μg/mL的溶液，分別測定其抗氧化特性，同時以相同濃度的VC溶液做對照。總還原力測定：采用鐵氰化鉀比色法，參照Lee等[1]的方法測定。DPPH自由基（二苯代苦味肼基自由基）清除活性分析：采用比色法，參照Gulcin等[18]和Roussis等[19]的方法測定。抗脂質(zhì)過氧化能力分析：參照Wang等[20]的方法測定。各提取物的抗氧化活性評價采用其IC50（即發(fā)揮50%抗氧化活性時的濃度，μg/mL）進行比較，該值越低說明其氧化活性越強[16-18]。

1.2.4 提取物抑菌活性分析 參照文獻[21]中的方法，做適當調(diào)整。將菌種用營養(yǎng)肉湯活化增殖12 h（37℃），使其菌體數(shù)量達到108cfu/mL。在無菌條件下，用滅菌生理鹽水（0.85%）稀釋至104cfu/mL，吸取稀釋菌液1.0 mL至滅菌培養(yǎng)皿中，再加入提取物溶液1.0 mL（20 mg/mL）和20 mL滅菌液體PCA培養(yǎng)基，迅速混合均勻，冷卻至培養(yǎng)基凝固，然后于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d。計數(shù)每個培養(yǎng)皿中的菌落總數(shù)，按照下式計算提取物對每種細菌的抑菌率：

抑菌率（%）=（1-C1/C2）×100

式中：C1—培養(yǎng)3d后培養(yǎng)皿中的菌落總數(shù)；C2—培養(yǎng)前實際加入的菌體數(shù)量。

Nisin是目前公認的一種安全防腐劑，在本實驗中作為芡種殼提取物抑菌性強弱的對照。

1.2.5 提取物組分分析 樣品處理：參照文獻[22]的方法。取20～30 mg提取物，溶解于2 mL溶劑中，再加入10 mL 1 mol/L鹽酸溶液，加熱回流30 min后，將樣液過濾，濾液再經(jīng)0.45 μm膜過濾后，用于高效液相色譜（HPLC）分析。

HPLC條件：經(jīng)反復實驗，最終確定HPLC分析的參數(shù)為：Waters e2695 HPLC，Waters 2489 UV-visible檢測器，XBridgeTM C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）。流動相：甲醇∶1%乙酸（30∶70，v/v），流速1.0 ml/mL，檢測波長240 nm，進樣量5 μL，柱溫35℃。

提取物組分分析：采用蘆丁、沒食子酸、綠原酸、兒茶素、表兒茶素等標準物質(zhì)作為對照品，以保留時間定性，峰面積定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2010和DPS 7.55數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進行分析。實驗數(shù)據(jù)均重復測定3次，取平均值，表示為：平均值±標準差（SD），應(yīng)用DPS 7.55數(shù)據(jù)處理軟件對不同處理之間的顯著性差異進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物理化組分分析

芡種殼中總酚含量較高（183.17 mg/g），所得提取物A、B、C和D中以無水乙醇提取物（B）中的總酚含量最高（763.65 mg/g），熱水提取物D中最低（387.62 mg/g）。用乙酸乙酯、乙醇、50%乙醇水溶液和水等四種不同極性有機溶劑進行分級提取，樣品總得率32.53%，芡種殼中總酚提取率98.22%（表1）?？偺欠治鼋Y(jié)果顯示，4種芡種殼提取物中總糖含量接近（8.57%、11.72%、12.32%、10.47%），但其溶液中并未檢測出游離低聚糖（HPLC法），由此推測芡種殼提取物中可能含有糖苷結(jié)構(gòu)，類似單寧酸分子中含有葡萄糖基團一樣[23]，經(jīng)苯酚-硫酸法測定，其分子中的糖苷鍵發(fā)生水解，釋放出糖分子，故而可測得其中的總糖含量。依次推測，4種芡種殼提取物中均含有酚類物質(zhì)，其具體組成還有待后續(xù)分析。

表1 提取物組分分析Table 1 The compositions analysis of extracts

2.2 芡種殼提取物抗氧化特性分析

2.2.1 總還原力 隨濃度增加，4種提取物的總還原力幾乎呈線性增加（圖1），不同濃度提取物總還原力存在極顯著差異（p≤0.01）。根據(jù)其IC50值（μg/mL）進行評價，乙醇提取物B的總還原力最高，其次是A、C、維生素C（VC）和D（表2）。在10～50 μg/mL范圍內(nèi)，四種芡種殼提取物均顯示出較強的總還原力，其中的提取物D與VC的總還原力無顯著差異（p＞0.05），A、B和C三種提取物均顯著高于同濃度的VC溶液（p＜0.05），表明芡種殼提取物具有很強的還原性。

圖1 提取物總還原能力Fig.1 The total reducing ability of extracts

表2 提取物抗氧化活性的IC5（0μg/mL）Table 2 The IC50of extracts antioxidative activity（μg/mL）

2.2.2 清除DPPH自由基（DPPH·）活性 4種提取物對DPPH·均顯示出較強的清除作用，在較低的濃度范圍內(nèi)（0～50 μg/mL），提取物A、B、C對DPPH·的清除活性均高于VC，在100 μg/mL時，A、B、C三種提取物的DPPH·清除率均超過80%，與VC持平（圖2）。說明芡種殼提取物具有較強的DPPH·清除活性。

根據(jù)其IC50值，提取物和VC對DPPH·的清除活性次序為：C＞B＞A＞VC＞D，不同提取物間的IC50值差異顯著（p＜0.05）（表2）。水提取物D的DPPH·清除活性相對較低，這可能與其較低的總酚含量（387.62 mg/g）有關(guān)。

圖2 提取物對DPPH·的清除活性Fig.2 The scavenging activity of extracts against DPPH·

2.2.3 抗脂質(zhì)過氧化活性 4種芡種殼提取物對Fe2+引發(fā)的亞油酸過氧化具有較強的抑制率，且隨濃度的增加，其脂質(zhì)過氧化抑制率顯著增加（p＜0.01）（圖3），據(jù)其IC50，4種芡種殼提取物的脂質(zhì)過氧化抑制活性依次為：B＞C＞A＞D（表2）。酚羥基具有較強的還原力，可有效還原脂質(zhì)過氧化物，并且在分子內(nèi)和分子間能形成締合氫鍵，成為一個大的供氫體，阻斷脂類自由基的鏈式反應(yīng)，進而防止過氧化物積累所造成的亞油酸過氧化[18，23]。本實驗中，芡種殼提取物對亞油酸過氧化體系的抑制活性較強。

圖3 芡種殼提取物脂質(zhì)過氧化抑制活性Fig.3 The lipids peroxidation inhibition activity of extracts

2.3 提取物抑菌性分析

本實驗所用15種微生物多為食品中常見的致腐或致病菌，涉及革蘭氏陰性菌、陽性菌和真菌。抑菌率分析結(jié)果顯示，4種芡種殼提取物中，以乙酸乙酯提取物（A）的抑菌活性最強，15中實驗菌種中，除對枯草芽孢桿菌抑菌率較弱外，對其他菌種的抑菌率均＞90%，甚至100%。其次是乙醇提取物（B），其抑菌活性略低于提取物A。提取物C和D的抑菌活性相對較弱，尤其是提取物D。結(jié)果顯示，Nisin對實驗所用15種微生物均顯示出很強的抑菌活性，其抑菌活性總體上要優(yōu)于芡種殼提取物（表3）。

表3 芡種殼提取物抑菌性分析結(jié)果Table 3 Antibacterial activities of gorgon nut shell extracts on 15 kinds of microbials

此外，雖然4種芡種殼提取物對不同微生物顯示不同強度的抑菌活性，但對大腸桿菌O157、阪崎腸桿菌和單增李斯特菌等3種實驗用菌種均顯示出較強的抑菌活性。

2.4 提取物組分的HPLC分析

目前有關(guān)芡實中多酚物質(zhì)組成的相關(guān)文獻很少，因此標準物質(zhì)選擇時缺乏依據(jù)，只能選擇5種自然界植物中分布最為廣泛的多酚物質(zhì)（沒食子酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素和蘆?。┳鳛镠PLC的多酚對照物質(zhì)。經(jīng)HPLC-UV分析，從芡種殼提取物中初步檢測出5種多酚化合物，分別為：沒食子酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素和蘆丁，其HPLC分離圖譜及相對含量分別見圖4和表4。因芡種殼中多酚物質(zhì)的參考資料有限，還有部分其他未知組分有待進一步定性。

結(jié)果表明，4種芡種殼提取物中均含有豐富的蘆丁和沒食子酸，其中含量最高的組分是蘆丁。這些組分均為公認的強抗氧化活性組分，其中，沒食子酸是常見的食品抗氧化劑，具有抗菌、抗病毒的功能，蘆丁和綠原酸是許多中成藥中的有效組分。尤其是蘆丁具有降低毛細血管通透性和脆性的作用，保持及恢復毛細血管的正常彈性，臨床上用于防治高血壓腦溢血、糖尿病視網(wǎng)膜出血和出血性紫癜等[24]。

圖4 芡種殼提取物的HPLC圖Fig.4 The HPLC potography of gorgon nut shell extracts

表4 芡種殼提取物組分的HPLC分析結(jié)果Table 4 The compositions of gorgon nut shell extracts analyzed by HPLC method

3 結(jié)論

本實驗依次采用乙酸乙酯、乙醇、50%乙醇水溶液和水等這四種極性依次增加的溶劑體系，對芡種殼中的活性組分進行分級提取，分別得到A、B、C和D等4種提取物，其中總酚平均值分別為547.23、763.65、517.04、387.62 mg/g。體外抗氧化分析表明，這4種芡種殼提取物具有較強的還原性和清除DPPH·活性，高于或接近于相同濃度的VC，芡種殼提取物顯示出很強的脂質(zhì)過氧化抑制活性。此外，芡種殼提取物顯示出較強的、且比較廣譜的抑菌活性，其中，提取物A和B的抑菌活性較強，在天然抗氧化劑領(lǐng)域具有一定應(yīng)用潛力。HPLC分析結(jié)果表明，芡種殼提取物中含有豐富的沒食子酸、兒茶素、綠原酸和蘆丁等4種多酚化合物，尤其是蘆丁的含量很高。

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Antioxidative and antibacterial activities of Euryale ferox Salisb.shell extracts and its compositions analysis

ZHANG Cuan，CHEN Zhi-hong，HE Xiao-wei，YU Shi-jun，BAI Yu
（College of Biology and Food Engineering，Chuzhou University，Chuzhou 239000，China）

Four kinds of extracts were extracted from Euryale ferox Salisb.shell with different solvents，such as，ethyl acetate，ethanol，50%aqueous ethanol and hot water（70～80℃），respectively.The antioxidative properties of four extracts were evaluated with the method of total reducing capacity，scavenging NO2-and DPPH· activities and lipid peroxidation inhibition ability，respectively.The microbial method was used to analyze the antibacterial activity of extracts to 15 kinds of bacterials.The main compositions of extracts analyzed with HPLC method in the article.The results showed that high content polyphonic compounds were obtained in four extracts，and exhibited strong total reducing power，DPPH·scavenging activity，possessed significant lipid peroxidation inhibition activity and moderate NO2-scavenging activities.Four kinds of extracts exhibited strong antibacterial activity to three kinds of common pathogens，such as，Escherichia coli O157，Enterobacter sakazakii and Listeria monocytogenes.By standard substances qualitative，five kinds of polyphenols were determined form extracts，they were gallic acid，catechin，epicatechin，chlorogenic acid and rutin，respectively.In a conclusion，the extracts possessed strong antioxidant capacity and antibacterial activities，which may be closely related to the high content polyphenols，so，they could be potential in food antioxidant.

Euryale ferox Salisb.shell extracts；antioxidant capacity；antibacterial activity；composition analysis

TS251.1

A

1002-0306（2015）22-0151-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.023

2015－03－01

張汆（1970-），女，博士，副教授，主要從事食品化學與營養(yǎng)學、膳食蛋白方面的研究，E-mail：zhangchuan2005@126.com。

2014年度公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303039）；滁州學院重點科研項目（2012kj006Z）。