銀杏葉多糖分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化活性研究

何 鋼，劉 嵬，李會萍，梁 立，郭曉強(qiáng)，顏 軍，茍小軍

（成都大學(xué)藥食同源植物資源開發(fā)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610106）

銀杏葉多糖分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化活性研究

何 鋼，劉 嵬，李會萍，梁 立，郭曉強(qiáng)，顏 軍，茍小軍*

（成都大學(xué)藥食同源植物資源開發(fā)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610106）

目的：分離純化銀杏葉多糖（GBLP）并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征及抗氧化活性研究。方法：超聲輔助提取制備銀杏葉粗多糖，經(jīng)精制除雜和陰離子交換柱分離獲得多糖級分，采用高效凝膠過濾色譜（HPGFC）、氣相色譜法（GC）分析相對分子質(zhì)量和單糖組成；采用體外抗氧化方法評價銀杏葉多糖抗氧化活性。結(jié)果：GBLP經(jīng)分離后獲得三個級分GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ，其相對分子質(zhì)量（Mw）分別為41861、361352、637533。GBLPⅠ由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成；GBLPⅡ和GBLPⅢ由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖組成，但其摩爾比不同。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明GBLPⅢ對羥自由基的清除能力最強(qiáng)，其次為GBLPⅡ、GBLPⅠ、GBLP；而GBLPⅡ和GBLPⅢ對超氧陰離子清除能力相對較好，其次為GBLPⅠ、GBLP。結(jié)論：銀杏葉多糖各級分的單糖組成比例、相對分子質(zhì)量有差異；對羥自由基的清除作用強(qiáng)于對超氧陰離子的清除作用，對羥自由基的清除作用差異可能與Mw及結(jié)構(gòu)相關(guān)。

銀杏葉多糖，分離純化，相對分子質(zhì)量，單糖組成，抗氧化

銀杏（Ginkgo biloba）是裸子植物門、銀杏科、銀杏屬單種植物，有近2億年的歷史，被稱為“活化石”。銀杏種子和葉具有重要的藥用價值。銀杏種子含有抗氧化活性和保護(hù)DNA受損傷的蛋白質(zhì)[1]。銀杏葉提取物具有活血、止咳、擴(kuò)張冠狀動脈血管、降低血膽固醇、抗抑郁等多種功效，其相關(guān)藥品已經(jīng)用于臨床治療。銀杏葉主要化學(xué)成分有萜類、多酚類、烷基酚、黃酮及黃酮甙類、萜內(nèi)酯類、多糖類化合物[2-6]。多糖是由多個單糖或單糖衍生物聚合而成的大分子化合物，具有諸多藥理活性，銀杏外種皮多糖的單糖組成、相對分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及抗氧化和抗腫瘤活性已有文獻(xiàn)報道[7-9]，為其開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。近年來的研究表明銀杏葉多糖也具有潛在的藥用價值和醫(yī)藥開發(fā)價值。研究表明銀杏葉多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥、抗衰老等多種功效[10-13]。而對銀杏葉多糖的結(jié)構(gòu)研究還不夠深入，多糖一級結(jié)構(gòu)特征、空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)效關(guān)系研究較少。目前對銀杏葉多糖的種類、單糖組成和相對分子質(zhì)量已有報道，但是各實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果存在一定的差異，因此對銀杏葉多糖深入研究具有重要的意義。在前人的研究基礎(chǔ)上以秋季采收的銀杏葉為材料制備銀杏葉多糖，并對其進(jìn)行分離純化，檢測其單糖組成、相對分子質(zhì)量和體外抗氧化活性，為銀杏葉多糖的結(jié)構(gòu)研究和資源利用做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏葉 9月中旬采自成都大學(xué)校園；鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、維生素C、濃硫酸、苯酚、氫氧化鈉、氯化鈉、Tris堿、水楊酸、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、正丁醇、三氯甲烷、三氟乙酸、鹽酸羥胺、吡啶、甲醇、乙酸酐、濃鹽酸、無水乙醇、過氧化氫 分析純，成都科龍化學(xué)試劑公司；標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000） 購自Solarbio公司。

UP-500純水儀 成都優(yōu)普科學(xué)儀器公司；DL-6M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀儀器公司；CT15RT臺式高速冷凍離心機(jī) 上海天美儀器公司；UV-2802紫外可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器公司；KQ-400KDE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司；凍干機(jī) 美國Labconco儀器公司；AKTA prime plus蛋白質(zhì)層析系統(tǒng) 美國通用儀器公司；RE-2000、RE-5210A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮儀器公司；GC-2010氣相色譜儀 日本島津儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 銀杏葉多糖的制備

1.2.1.1 銀杏葉粗多糖的制備 銀杏葉經(jīng)60℃烘干后粉碎，銀杏葉粉用石油醚（沸程60～90℃）蒸餾回流2次，每次2.5 h。濾渣置于托盤中揮走石油醚后備用，稱取1 kg脫脂處理的銀杏葉粉參照文獻(xiàn)[7，10]方法，采用溫度80℃，料液比1∶50，超聲提取時間10 min，超聲功率400 W，提取三次合并提取液，提取液經(jīng)6000 r/min離心15 min，90℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至4 L，加入4倍體積的無水乙醇過夜沉淀多糖，多糖沉淀10000 r/min離心10 min獲得粗多糖。采用硫酸-苯酚法[14]測定銀杏葉粗多糖提取液中多糖含量，多糖提取得率（%）=（溶液中多糖濃度×提取液總體積）/銀杏葉總質(zhì)量×100。

1.2.1.2 銀杏葉多糖的精制 取適量銀杏葉粗多糖加蒸餾水復(fù)溶，采用Sevag試劑法[9]清除多糖溶液中的蛋白質(zhì)和核酸等雜質(zhì)，采用UV光譜儀分析精制多糖溶液，波長掃描范圍200～600 nm，除雜多糖溶液在254 nm和280 nm檢測無吸收峰為止。除雜多糖溶液按5∶1（mL/g）同D101大孔樹脂混合，攪拌均勻，靜態(tài)吸附色素4～5 h后，多糖溶液連同柱料一起裝柱，收集流出液即為脫色多糖溶液。多糖溶液再經(jīng)透析（透析袋截留分子量8000～14000）去除小分子化合物，袋內(nèi)溶液經(jīng)真空冷凍干燥后得到精制多糖。

1.2.2 銀杏葉精制多糖的分離純化 稱取0.5 g精制銀杏葉多糖（GBLP），加入10 mL蒸餾水充分溶解后10000 r/min離心10 min，上清液用陰離子交換柱DEAE-Sepharose Fast Flow進(jìn)行分離，以1 mL/min流速進(jìn)行洗脫。先用蒸餾水洗脫100 mL，然后用0～1.0 mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫150 mL，最后再用1.0 mol/L NaCl溶液洗脫50 mL。每支試管收集3 mL。收集液用硫酸-苯酚法測定A490nm值[14]，以試管編號為橫坐標(biāo)，A490nm值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。

1.2.3 銀杏葉多糖級分相對分子質(zhì)量測定 銀杏葉多糖級分相對分子質(zhì)量的測定采用高效凝膠過濾色譜法[15]（HPGFC）。色譜條件：色譜柱型號YMC Pack-Diol 200（300 mm×8.0 mm，5 μm，200 ?），流動相為超純水，流速0.8 mL/min，柱溫35℃，檢測器為示差折光檢測器（RI），進(jìn)樣量20 μL。

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以葡萄糖（Glc）及標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000為標(biāo)準(zhǔn)品，分別用超純水溶解配制成2 mg/mL溶液進(jìn)樣，記錄洗脫峰的保留時間。葡萄糖標(biāo)液進(jìn)樣測得Vt，T-2000標(biāo)液測得外水體積V0。分別用T-500、T-70、T-40、T-10的標(biāo)準(zhǔn)溶液相繼進(jìn)樣，分別求得它們的洗脫體積Ve。相對分子質(zhì)量Mw與其在凝膠柱上的洗脫體積Ve、分配系數(shù)Kav存在如下關(guān)系：

Ve=a-blnMw

Kav=K1-K2lnMw

Kav=（Ve-V0）/（Vt-V0）

式中：a、b、K1、K2為常數(shù)。

以Kav對lnMw進(jìn)行線性回歸處理，得線性回歸方程。

1.2.3.2 樣品相對分子質(zhì)量的測定 分別取銀杏葉多糖各級分配制成2 mg/mL的溶液，按上述條件進(jìn)行色譜分析，記錄樣品保留時間。由樣品保留時間計(jì)算該銀杏葉多糖級分在凝膠柱上的洗脫體積Ve，從而獲得分配系數(shù)Kav，制作的回歸方程即可得該銀杏葉多糖級分的相對分子質(zhì)量Mw。

1.2.4 紅外光譜分析 銀杏葉多糖各級分經(jīng)凍干后分別用KBr研磨均勻，壓片后進(jìn)行紅外光譜分析，掃描范圍為400～4000 cm-1。

1.2.5 糖腈衍生化分析銀杏葉各級分單糖組成

1.2.5.1 氣相色譜條件 色譜柱：FFAP毛細(xì)管柱，長為30 m，膜厚為0.25 μm，內(nèi)徑為0.25 mm。載氣：氮?dú)?，控制方式：線速度，壓力：144.4 kPa，總流量：6.9 mL/min，柱流量：1.29 mL/min，線速度：36.7 cm/s，吹掃流量：3.0 mL/min，分流比：2∶1。程序升溫：初始柱溫170℃，保持2 min；然后以4℃·min-1的升溫速率升至187℃；再以0.5℃·min-1的升溫速率升至188℃，保持1 min；以1℃·min-1的升溫速率升到196℃，保持2 min；以4℃·min-1的升溫速率升到208℃，保持1 min；以0.5℃·min-1的升溫速率升至209℃，保持3 min。

1.2.5.2 混合單糖溶液配制 精確稱取內(nèi)標(biāo)化合物山梨醇10.0 mg于25 mL容量瓶中用無水吡啶溶解并定容至刻度。精確稱取單糖標(biāo)準(zhǔn)品（果糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖）各100.0 mg于25 mL容量瓶中，用無水吡啶溶解并定容至刻度。并用無水吡啶對混合單糖溶液進(jìn)行2倍稀釋。

1.2.5.3 銀杏葉多糖的水解樣品制備 準(zhǔn)確稱取多糖樣品10.0 mg于安培瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸（TFA）2 mL，充N2封管，于110℃烘箱中水解6 h，水解液10000 r/min離心5 min，取上清液于西林瓶中，加適量甲醇，蒸干備用，待衍生化時用1 mL無水吡啶復(fù)溶。

1.2.5.4 糖腈衍生化 分別取上述梯度稀釋的混合單糖溶液和多糖水解溶液1 mL于具塞試管中，再分別準(zhǔn)確加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液和1 mL鹽酸羥胺溶液（15 mg/mL），混勻后封管，在80℃水浴中反應(yīng)30 min；反應(yīng)后冷卻至室溫，分別加入0.8 mL乙酸酐溶液，封管后于70℃水浴中乙?；磻?yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)溶液移入西林瓶中，水浴鍋蒸干后用1 mL氯仿溶解，然后進(jìn)行氣相色譜分析。

1.2.6 銀杏葉多糖抗氧化活性的測定

1.2.6.1 清除羥基自由基（·OH-）的活性測定 向試管中加入一系列不同濃度多糖溶液1.0 mL，F(xiàn)eSO4溶液（1.8 mmol/mL）2.0 mL，水楊酸-乙醇（1.8 mmol/mL）1.5 mL，最后加濃度為0.3%的H2O2溶液0.1 mL啟動反應(yīng)，振蕩混合，37℃水浴保溫30 min，在波長510 nm下測量各自的吸光度值。以1.0 mL蒸餾水代替多糖溶液，其余操作同上作為空白，VC作陽性對照[16]。

羥基自由基清除率計(jì)算公式為：

清除率（%）=[（A0－AS）/A0]×100

式中，A0為空白管的吸光度，AS為樣品的吸光度。IC50值的計(jì)算，以多糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)作圖并進(jìn)行回歸分析，清除率為50%時所對應(yīng)的多糖濃度即為IC50值。

1.2.6.2 對超氧陰離子（·O2-）的清除作用 0.1 mL不同濃度的多糖溶液，加入5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH8.2），25℃水浴10 min，加入0.2 mL 6 mmol/L的鄰苯三酚溶液，搖勻后每隔30 s在325 nm處測定吸光度值，4 min內(nèi)測量完成。以0.1 mL水代替多糖溶液，0.2 mL水代替鄰苯三酚作參比液，0.1 mL水代替多糖溶液作對照溶液，其余同上述方法操作，VC作陽性對照[16]。

清除率（%）=（1－樣品斜率/對照斜率）×100

式中，斜率指以間隔時間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，所得回歸方程的斜率。IC50值的計(jì)算，以多糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)作圖并進(jìn)行回歸分析，清除率為50%時所對應(yīng)的多糖濃度即為IC50值。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

各組數(shù)據(jù)以X±SD表示，數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 銀杏葉多糖的精制

銀杏葉多糖提取液經(jīng)硫酸苯酚法測得A490nm值代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.6771x－0.0136，R2=0.9981，計(jì)算銀杏葉粗多糖提取得率為6.87%。多糖溶液經(jīng)Saveg試劑除雜處理和大孔樹脂脫色處理后的紫外光譜分析如圖1，由圖1可知254 nm和280 nm處無吸收峰，表明多糖中蛋白質(zhì)和核酸等雜質(zhì)已去除，多糖得到精制。

圖1 精制銀杏葉多糖溶液紫外光譜圖Fig.1 UV spectrum of purifed G.biloba leaf polysaccharides

2.2 精制銀杏葉多糖的分離純化

精制的GBLP經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow柱分離結(jié)果如圖2，由圖2可知GBLP經(jīng)分離后獲得三個級分，分別命名為GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ。

圖2 GBLP的洗脫曲線Fig.2 GBLP elution curves

2.3 銀杏葉多糖相對分子質(zhì)量

系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000的保留時間見表1，以分配系數(shù)Kav為橫坐標(biāo)，相對分子質(zhì)量的對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，并通過回歸處理得線性回歸方程為y=－9.1239x＋14.254，R2=0.9969（圖3）。

表1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPGFC保留時間Table 1 HPGFC retention time of standard sample

圖3 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Relative molecular mass standard curve

利用高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）將銀杏葉多糖分離后的各級分樣品在相同色譜條件下進(jìn)樣分析，并記錄GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ色譜峰的保留時間，通過線性回歸方程，計(jì)算GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ的相對分子質(zhì)量（Mw）分別為41861、361352、637533。

2.4 銀杏葉多糖級分紅外光譜分析

各多糖級分紅外光譜檢測結(jié)果如圖4所示。在3409 cm-1附近出現(xiàn)一個寬峰，是多糖特征的O-H的伸縮振動峰，表明多糖存在分子內(nèi)和分子間的氫鍵；2915 cm-1附近弱吸收峰為飽和的C-H伸縮振動峰；1623 cm-1附近的吸收峰為C=O伸縮振動峰，1424、1384 cm-1附近的吸收峰為=CH2的變形吸收峰。在（950～700 cm-1）864 cm-1處具有吸收峰，表明銀杏葉多糖含有甘露糖。由紅外圖譜可知GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ具有明顯的糖類化合物的特征。

圖4 銀杏葉多糖紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of Ginkgo biloba leaf polysaccharides

2.5 銀杏葉多糖的單糖組成分析

2.5.1 混合單糖糖腈衍生化產(chǎn)物法標(biāo)準(zhǔn)曲線 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液和銀杏葉精制多糖水解產(chǎn)物進(jìn)行糖腈衍生化后經(jīng)GC分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，每種單糖進(jìn)樣前濃度與校正因子的積為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程、相關(guān)系數(shù)。由圖5可以看出各單糖及內(nèi)標(biāo)化合物在該色譜條件下分離度好，由表2結(jié)果可知各單糖線性關(guān)系良好。

圖5 混合單糖氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatography of mixture of standard monosaccharides

表2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curve of standard monosaccharides derivatization

圖6 銀杏葉多糖各級分的氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatography of Ginkgo biloba leaf polysaccharide components

2.5.2 銀杏葉多糖各分離級分的單糖組成 銀杏葉多糖分離后的三個級分GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ分別經(jīng)水解，糖腈衍生化后進(jìn)行GC分析并記錄各單糖峰面積，結(jié)果如圖6。GBLPⅠ由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，其摩爾比為：1∶3.5∶18.2∶7.4∶7.5；GBLPⅡ由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖組成，其摩爾比為：1.5∶1.6∶1∶2.2；GBLPⅢ由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖組成，其摩爾比為：1.6∶1∶1.1∶1.7。

2.6 銀杏葉多糖活性的測定

2.6.1 對羥基自由基的清除作用 銀杏葉精制多糖（GBLP）及GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ對羥自由基的清除作用結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，當(dāng)VC濃度達(dá)0.5 mg/mL時其對羥基自由基清除率達(dá)93.28%，清除作用強(qiáng)于銀杏葉多糖。銀杏葉多糖級分濃度增加清除率增大，GBLPⅢ清除作用強(qiáng)于GBLPⅡ、GBLPⅠ、GBLP，對羥自由基清除率的IC50值分別為0.96、2.10、3.23、3.67 mg/mL。同時也表明銀杏葉多糖分離后的各級分對羥基自由基清除活性高于分離前的混合多糖。

圖7 銀杏葉多糖對·OH的清除率Fig.7 Hydroxyl radical scavenging activity of GBLP

2.6.2 對超氧陰離子的清除作用 銀杏葉精制多糖（GBLP）及GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ對超氧陰離子的清除作用結(jié)果如圖8所示。同陽性對照VC相比較，銀杏葉多糖對超氧陰離子的清除作用較差，當(dāng)樣品濃度為6 mg/mL時VC對超氧陰離子的清除率達(dá)99.70%，而GBLP為6.96%，GBLPⅠ為7.42%，GBLPⅡ?yàn)?.39%，GBLPⅢ為9.00%。在濃度為0.5～6 mg/mL范圍內(nèi)GBLPⅡ和GBLPⅢ對超氧陰離子的清除活性較GBLPⅠ和GBLP高。

圖8 銀杏葉多糖對超氧陰離子的清除率Fig.8 Superoxide anion radical scavenging activity of GBLP

3 結(jié)論

銀杏葉粗多糖經(jīng)陰離子交換柱分離純化獲得三個級分GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ，通過高效凝膠色譜法分析其相對分子質(zhì)量（Mw）分別為41861、361352、 637533。單糖組成分析和紅外光譜數(shù)據(jù)表明GBLPⅠ可能是以甘露糖為主鏈組成的雜多糖，而GBLPⅡ和GBLPⅢ可能是以半乳糖為主鏈組成的雜多糖。單糖組成的研究結(jié)果同靳菊情[17]、Josefkraus[18]、楊靜峰等[19]報道較一致，而相對分子質(zhì)量結(jié)果有一定差別，可能與測定的方法有關(guān)。同VC相比較，銀杏葉多糖對羥基自由基和超氧陰離子的清除作用較弱，但是GBLPⅢ對羥基自由基的清除作用強(qiáng)于GBLPⅡ、GBLPⅠ以及GBLP，表明分離后銀杏葉多糖級分對羥基自由基清除活性提高。而銀杏葉多糖對超氧陰離子的清除作用較弱，GBLPⅡ和GBLPⅢ對超氧陰離子的清除作用強(qiáng)于GBLPⅠ和GBLP。研究結(jié)果也表明在一定的濃度范圍內(nèi)銀杏葉多糖對羥基自由基和超氧陰離子的清除作用具有明顯的劑量效應(yīng)。銀杏葉多糖各級分之間的單糖組成比例、相對分子質(zhì)量存在明顯差異，同時對羥自由基的清除作用也存在差異，這可能與Mw及結(jié)構(gòu)相關(guān)。

[1]Wen H，QianC D，BiJ X，et al.Purification and characterization of an antioxidant protein from Ginkgo biloba seeds[J].Food Research International，2010（43）：86-94.

[2]Bikram S，Pushpinder K，Gopichand R D，et al.Biology and chemistry of Ginkgo biloba[J].Fitoterapia，2008（79）：401-418.

[3]Patricia R，Norma SG，Omar N MC，et al.Antidepressant-like effect of a Ginkgo biloba extract（EGb761）in the mouse forced swimming test：Role ofoxidative stress[J].Neurochemistry International，2011（59）：628-636.

[4]Satyan S K，A PS，F(xiàn)abio C C，et al.Antidepressant and Antistress Activity of GC-MS characterized Lipophilic Extracts of Ginkgo biloba Leaves[J].Phytother Research，2007（21）：1061-1065.

[5]Teris A B，Paola M.Chemical analysis and quality control of Ginkgo biloba leaves，extracts，and phytopharmaceuticals[J]. Journal of Chromatography A，2009（1216）：2002-2032.

[6]ChenH Y，Jing C，YaoK X，et al.Optimization of multistage countercurrent extraction of antioxidants from Ginkgo biloba L.Leaves[J].Food and Bioproducts Processing，2012（90）：95-101.

[7]Jing J C，Tao Z，Bo J，et al.Characterization and antioxidant activity of Ginkgo biloba exocarp polysaccharides[J].Carbohydrate Polymers，2012（87）：40-45.

[8]Ai H X，Hua S C，Bu C S，et al.Therapeutic mechanism of ginkgo biloba exocarp polysaccharides on gastric cancer[J]. World J Gastroenterol，2003，9（11）：2424-2427.

[9]XiangY W，Guang H M，Ting Z，et al.Isolation，purification and in vitro anti-tumor activity of polysaccharide from Ginkgo biloba sarcotesta[J].Carbohydrate Polymers，2011（86）：1073-1076.

[10]FeiY，Rong M Y，Yin Y，et al.Structure characterization and antioxidant activity of a novel polysaccharide isolated from Ginkgo biloba[J].International Journal of Biological Macromolecules，2010（46）：436-439.

[11]Bo J，Hong Y Z，Chang J L，et al.Extraction of water-soluble polysaccharide and the antioxidant activity from Ginkgo biloba leaves[J].Medicinal Chemistry Research，2010（19）：262-270.

[12]陳群，劉天驕.銀杏葉多糖的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用[J].中藥藥理與臨床，2003，19（5）：18-19.

[13]劉春明.銀杏葉多糖抗炎癥作用的研究[D].長春：東北師范大學(xué)，2007.

[14]徐光域，顏軍，郭曉強(qiáng)，等.硫酸-苯酚定糖法的改進(jìn)與初步應(yīng)用[J].食品科學(xué)，2005，26（8）：342-346.

[15]郭曉強(qiáng)，顏軍，何鋼，等.硫酸酯化川芎多糖的制備及其抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25（7）：955-959.

[16]郭曉強(qiáng)，何鋼，倩姚，等.普通念珠藻中多糖的分離純化研究[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2013（3）：328-330.

[17]靳菊情，丁東寧，邊小麗，等.銀杏葉多糖的化學(xué)及清除羥自由基作用[J].西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000，21（5）：417-419.

[18]Josefkraus.Water-soluble polysaccharides from Ginkgo biloba leaves[J].Phytochemistry，1991，30（9）：3017-3020.

[19]楊靜峰，張旭，梁忠?guī)r，等.銀杏葉水溶性多糖的分離、純化、初步鑒定及活性研究[J].特產(chǎn)研究，2006，28（4）：51-53.

Isolation and purification，structure identification and antioxidant activity of polysaccharides of Ginkgo biloba leaf

HE Gang，LIU wei，LI Hui-ping，LANG Li，GUO Xiao-qiang，YAN Jun，GOU Xiao-jun*
（Key Laboratory of Medicinal and Edible Plants Resources Development of Sichuan Education Department，Chengdu University，Chengdu 610106，China）

Objective：Isolation and purified the polysaccharide from Ginkgo biloba leaf and investigated its structure characterization，antioxidant activity.Method：Extract polysaccharide from G.biloba leaf by ultrasonic assisted，crud polysaccharide was refined and then was isolated by anion exchange column，the relative molecular weight was measured by gel column chromatography，the monosaccharide composition was analyzed by GC，by adopting the method of in vitro antioxidant evaluation of G.biloba leaf polysaccharide antioxidant activity. Result：G.biloba leaf polysaccharide was purified and got three ingredients named GBLPⅠ，GBLPⅡand GBLPⅢ.The relative molecular weight（Mw）was 41861，361352，637533 respectively.GBLPⅠwas consisted of rhamnose，arabia，mannose，glucose，galactose composition.GBLPⅡ and GBLPⅢ were consisted of rhamnose，arabia，mannose，galactose composition，but and the molar ratio was different.The result of antioxidant experiment in vitro showed that the ability of GBLPⅢ scavenging on hydroxyl free radical was strongest，followed by GBLPⅡ，GBLPⅠ，GBLP.While the ability of GBLPⅡand GBLPⅢscavenging on superoxide anion was relatively good，followed by GBLP，GBLPⅠ.Conclusion：The monosaccharide composition and relative molecular mass of the fractions isolated from G.biloba leaf crude polysaccharide was difference.The ability of G.biloba leaf polysaccharide on hydroxyl free radical scavenging was stronger than the scavenging on superoxide anion，the hydroxyl free radical scavenging effect difference might be associated with Mw and structure.

Ginkgo biloba leaf polysaccharide；isolation and purification；relative molecular mass；monosaccharide composition；antioxidant

TS201.2

A

1002-0306（2015）22-0081-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.008

2015－03－17

何鋼（1982-），男，博士，講師，研究方向：糖生物化學(xué)，E-mail：hegang@cdu.edu.cn。

*通訊作者：茍小軍（1974-），男，博士，教授，研究方向：糖生物化學(xué)，E-mail：jmee@cdu.edu.cn。

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)計(jì)劃項(xiàng)目（2015JY0117）；四川省教育廳項(xiàng)目（14ZB0374）；四川省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（2014G001）。