“秋水仙素誘發(fā)蠶豆多倍體實(shí)驗(yàn)”中誘發(fā)因素最佳組合的探索

趙錦慧

高等植物染色體進(jìn)化有一個(gè)顯著的特征即染色體會(huì)加倍,植物染色體加倍后可以使植物的生態(tài)適應(yīng)力和對(duì)逆境的抗性增強(qiáng).主要表現(xiàn)為對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性增強(qiáng),抗寒、抗旱及抗病蟲害的能力增強(qiáng)[1-3].目前,秋水仙素是使用最多、應(yīng)用最廣泛的化學(xué)誘導(dǎo)劑.在一定的濃度范圍內(nèi),秋水仙素對(duì)培養(yǎng)材料沒有特殊要求,能明顯提高新生細(xì)胞的染色體加倍誘導(dǎo)率,經(jīng)秋水仙素處理后的細(xì)胞在正常條件下又可以恢復(fù)正常分裂.誘導(dǎo)多倍體時(shí),為了保證有較高的成功率,往往對(duì)秋水仙素的處理濃度和處理時(shí)間組合要求比較高[4].因此,實(shí)驗(yàn)室急需解決的問題就是針對(duì)某種植物,選出最適合的誘導(dǎo)方法進(jìn)行多倍體植株的誘導(dǎo),并因此獲得穩(wěn)定生長的多倍體植株[5].

本實(shí)驗(yàn)以蠶豆胚根膨大率和胚根誘導(dǎo)率為指標(biāo),再通過染色體的倍性變化、保衛(wèi)細(xì)胞大小的變化及氣孔大小對(duì)多倍體誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行鑒定.同時(shí),對(duì)誘導(dǎo)出的蠶豆多倍體植株的胚根和幼苗的生長狀況進(jìn)行調(diào)查分析,旨在篩選秋水仙素誘導(dǎo)蠶豆多倍體的最佳處理濃度和處理時(shí)間組合,為秋水仙素誘導(dǎo)蠶豆多倍體提供最佳的實(shí)驗(yàn)方案.

1 材料與方法

1.1 材料

蠶豆種子,購于周口市種子公司.

1.2 方法

1.2.1 種子處理、胚根培養(yǎng)及秋水仙素處理[6]

將蠶豆種子洗凈,用5%次氯酸鈉消毒1 h,在室溫(25℃)下浸種24 h后光照培養(yǎng).胚根長至1.5 cm左右時(shí),選取長勢一致的種子分成6組,分別用0.000%,0.025%,0.050%,0.100%,0.150%,0.200%的秋水仙素溶液浸泡.每組又分成4份,各份處理時(shí)間分別是12,24,48,60 h,“濃度×?xí)r間”共24個(gè)處理組合,以上每份處理50粒種子,處理后一半種子用于細(xì)胞學(xué)觀察,一半土培,長出幼苗后調(diào)查苗高和胚根的數(shù)量.

1.2.2 形態(tài)學(xué)上對(duì)蠶豆多倍體誘導(dǎo)結(jié)果的鑒定

統(tǒng)計(jì)胚根誘導(dǎo)率和胚根膨大率,在形態(tài)上對(duì)蠶豆多倍體誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行鑒定.胚根膨大率(%)=(根尖膨大后離根尖2 cm處的周長-對(duì)照組相應(yīng)位置的周長)/對(duì)照組相應(yīng)位置的周長×100.根尖誘導(dǎo)率(%)=(誘導(dǎo)膨大的根尖/對(duì)照組根尖總數(shù))×100[7].當(dāng)蠶豆根尖處理到第10 d和第15 d時(shí)分別調(diào)查各處理組的胚根數(shù)量和苗高.

1.2.3 細(xì)胞學(xué)上對(duì)蠶豆多倍體誘導(dǎo)結(jié)果的鑒定

調(diào)查胚根細(xì)胞染色體數(shù)目、氣孔及保衛(wèi)細(xì)胞大小和數(shù)量,在細(xì)胞學(xué)上對(duì)蠶豆多倍體誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行鑒定.胚根細(xì)胞染色體數(shù)目的鑒定方法為:取各處理組胚根20條,用卡諾氏固定液固定10 h后用蒸餾水沖洗2～3 min,然后用l mol/L的鹽酸在60℃水浴中解離20 min,蒸餾水洗滌3～5次,用刀片將蠶豆根尖縱切3～4片,最后用改良的苯酚品紅溶液染色8～10 min,壓片后在光學(xué)顯微鏡下觀察[8,9].從每個(gè)處理中隨機(jī)選擇20個(gè)制片進(jìn)行統(tǒng)計(jì),共統(tǒng)計(jì)100個(gè)處于分裂中期的細(xì)胞以及其中染色體加倍的細(xì)胞.氣孔及保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)量的鑒定方法為:各處理幼苗長出2～3片幼葉后,用刀片把第2片幼葉的上表皮及葉肉刮去,剩余的下表皮用改良的苯酚品紅溶液染色,光學(xué)顯微鏡下觀察氣孔及保衛(wèi)細(xì)胞的大小,并調(diào)查10×40倍光學(xué)顯微鏡下20個(gè)視野內(nèi)的各處理平均氣孔及保衛(wèi)細(xì)胞的數(shù)目.

1.2.4 數(shù)據(jù)分析方法

用SPSS 13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并用Duncan法進(jìn)行多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素不同處理濃度與處理時(shí)間對(duì)蠶豆根尖誘導(dǎo)率的影響

秋水仙素不同處理濃度與處理時(shí)間下蠶豆根尖誘導(dǎo)率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1.由圖1可以看出,蠶豆根尖誘導(dǎo)率隨秋水仙素處理濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢.秋水仙素處理濃度為0.100%時(shí),根尖誘導(dǎo)率最大;秋水仙素處理濃度為0.200%時(shí),根尖誘導(dǎo)率最小;秋水仙素處理濃度為0.025%～0.100%時(shí),根尖誘導(dǎo)率升高趨勢明顯;處理濃度為0.150%～0.200%時(shí),根尖誘導(dǎo)率下降趨勢明顯.隨處理時(shí)間的延長蠶豆根尖誘導(dǎo)率呈上升趨勢,處理60 h時(shí)根尖誘導(dǎo)率最大,12 h時(shí)根尖誘導(dǎo)率最小,在12～48 h之間根尖誘導(dǎo)率變化明顯,而48～60 h之間變化不明顯.這表明蠶豆根尖誘導(dǎo)率在不同誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)濃度之間差異明顯.這與郭英等[10]以及胡洲鶴等[11]研究結(jié)果相似.

把好加工關(guān)。按工藝流程規(guī)范操作，并做好以下幾點(diǎn)：不使用腐敗變質(zhì)、含有毒有害物質(zhì)的食品原料，不得回收餐廚廢棄物；嚴(yán)格實(shí)行“生熟分開”，避免食品受到各種致病菌的污染；需要熟制加工的食品要做到“燒熟煮透”，其中心溫度不得低于70℃，以保證殺滅食品中的有害微生物和有毒成分，對(duì)半成品和剩余食品進(jìn)行二次烹調(diào)加工時(shí)，中心溫度亦不能低于70℃；制定詳細(xì)的清洗消毒制度及操作規(guī)程，嚴(yán)格實(shí)施清洗消毒程序；對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)食品按規(guī)定程序進(jìn)行留樣。

2.2 秋水仙素不同處理濃度與處理時(shí)間對(duì)蠶豆胚根膨大率的影響

秋水仙素不同處理濃度與處理時(shí)間下蠶豆胚根膨大率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖2.由圖2可知,隨秋水仙素處理濃度的增加,蠶豆胚根膨大率呈先升高后降低的趨勢.秋水仙素處理濃度為0.100%時(shí),胚根膨大率最大;處理濃度為0.200%時(shí),胚根膨大率最小;處理濃度為0.025%～0.100%時(shí),胚根膨大率升高趨勢明顯;處理濃度為0.150%～0.200%時(shí),胚根膨大率下降趨勢明顯.隨處理時(shí)間的延長蠶豆胚根膨大率呈上升趨勢,處理60 h時(shí)胚根膨大率最大,12 h時(shí)胚根膨大率最小,在12～48 h之間胚根膨大率變化明顯,而48～60 h之間變化不明顯.這表明蠶豆胚根膨大率在不同誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)濃度之間差異明顯.這與閆秋潔等[7]研究結(jié)果相似.

圖1 秋水仙素不同處理濃度與處理時(shí)間下蠶豆根尖誘導(dǎo)率

圖2 秋水仙素不同處理濃度與處理時(shí)間下蠶豆胚根膨大率

2.3 秋水仙素不同處理濃度與處理時(shí)間對(duì)蠶豆胚根細(xì)胞染色體數(shù)目的影響

調(diào)查發(fā)現(xiàn),秋水仙素不同處理濃度與處理時(shí)間下,蠶豆胚根根尖細(xì)胞染色體有加倍現(xiàn)象,既有二倍體(2n=12),又有四倍體(4n=24)和八倍體(8n=48),但未發(fā)現(xiàn)異形染色體,也未發(fā)生染色體交叉丟失現(xiàn)象.這表明用秋水仙素誘導(dǎo)處理后除倍性發(fā)生變化外,染色體其余特征均與二倍體表現(xiàn)一致.這與陳高等[12]以及鄭寶強(qiáng)等[13]研究結(jié)果相似.

2.4 秋水仙素不同處理濃度與處理時(shí)間對(duì)蠶豆幼葉氣孔數(shù)量的影響

秋水仙素不同處理濃度與處理時(shí)間對(duì)蠶豆幼葉氣孔數(shù)量的影響見圖3.由圖3可知,與對(duì)照相比,秋水仙素各種處理下,幼葉的氣孔數(shù)量明顯減少.在10×40倍顯微鏡下,處理組一個(gè)視野內(nèi)平均氣孔數(shù)約為3～4個(gè),而對(duì)照組平均約5個(gè).方差分析結(jié)果表明,氣孔數(shù)量在不同的誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)濃度之間以及“時(shí)間×濃度”之間差異顯著(見表1).多重比較結(jié)果表明,處理時(shí)間為12 h和24 h時(shí)差異不顯著,48 h和60 h時(shí)差異也不顯著,但12～24 h與48～60 h之間差異顯著(見表2).處理濃度為0.025%時(shí)氣孔數(shù)量最多,與0.050%,0.100%濃度下的氣孔數(shù)量差異顯著,0.100%時(shí)氣孔數(shù)量最少,但與0.050%,0.150%和0.200%之間的氣孔數(shù)量差異不顯著.這與陳發(fā)棣等[14]、閻志紅等[15]及王鴻鶴等[16]研究結(jié)果相似.

圖3 各種處理下一個(gè)視野內(nèi)的平均氣孔數(shù)目(10×40倍顯微鏡下觀察)

2.5 秋水仙素不同處理濃度下保衛(wèi)細(xì)胞大小變化

10×40倍顯微鏡下觀察到,在秋水仙素不同處理濃度下,處理組與對(duì)照組相比,保衛(wèi)細(xì)胞均有不同程度地變大.在0.100%水平處理下保衛(wèi)細(xì)胞最大.這與李曉艷等[17]研究結(jié)果相似.

2.6 秋水仙素不同處理濃度與處理時(shí)間對(duì)蠶豆幼苗高度的影響

秋水仙素不同處理濃度與處理時(shí)間對(duì)蠶豆幼苗高度的影響見圖4、圖5.對(duì)圖4、圖5數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較,分析結(jié)果見表1、表2、表3.由表1、表2、表3知,經(jīng)秋水仙素處理10 d和15 d后,幼苗的高度在各處理時(shí)間之間以及“時(shí)間×濃度”之間差異不顯著,但各處理濃度之間差異顯著,并且隨著處理濃度升高苗高呈降低趨勢.秋水仙素處理10 d后,苗高在0.025%時(shí)最高,在0.200%時(shí)最低.苗高在0.100%和0.150%之間差異不顯著,其他處理濃度之間差異均顯著.秋水仙素處理15 d后,2個(gè)相鄰的處理濃度之間無顯著差異,但相隔的處理濃度之間有顯著差異.這與陳紹潘等[18]及匡全等[19]研究結(jié)果相似.

2.7 秋水仙素不同處理濃度與處理時(shí)間對(duì)蠶豆幼苗胚根數(shù)量的影響

秋水仙素不同處理濃度與處理時(shí)間對(duì)蠶豆胚根數(shù)量的影響結(jié)果見表1、表2、表3.由表1、表2、表3知,經(jīng)秋水仙素處理10 d和15 d后,胚根數(shù)量在各處理時(shí)間之間、各處理濃度之間以及“時(shí)間×濃度”之間差異不顯著,但對(duì)照組與各處理組之間差異極顯著.即在秋水仙素處理下,蠶豆幼苗胚根生長嚴(yán)重受到抑制.這與張素芝等[20]研究結(jié)果相似.

圖4 10 d后各處理下的幼苗高度

圖5 15 d后各處理下的幼苗高度

表1 秋水仙素不同處理時(shí)間和處理濃度下各變量的方差分析

2.8 秋水仙素誘導(dǎo)蠶豆多倍體的最佳“處理時(shí)間×處理濃度”組合的確定

秋水仙素誘導(dǎo)蠶豆多倍體的處理濃度和處理時(shí)間之間的互作見表1.由表1可以看出,在2種因素共同作用下,根尖誘導(dǎo)率和胚根膨大率與對(duì)照相比均達(dá)到顯著水平,再結(jié)合多重比較結(jié)果,確定秋水仙素誘導(dǎo)蠶豆多倍體的最適處理時(shí)間為48 h,最佳處理濃度為0.100%.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在秋水仙素處理下,蠶豆根尖誘導(dǎo)率、胚根膨大率升高,根尖細(xì)胞染色體數(shù)目增多,氣孔數(shù)量減少,保衛(wèi)細(xì)胞變大,胚根數(shù)量減少,幼苗高度降低.蠶豆根尖誘導(dǎo)率、胚根膨大率、氣孔數(shù)量在秋水仙素不同處理濃度、不同處理時(shí)間、不同“處理時(shí)間×處理濃度”組合之間差異顯著.胚根數(shù)量、幼苗高度在秋水仙素不同處理時(shí)間、不同“處理時(shí)間×處理濃度”組合之間差異不顯著,但不同處理濃度之間差異顯著.秋水仙素誘導(dǎo)蠶豆多倍體的最適處理時(shí)間為48 h,最佳處理濃度為0.100%.

表2 秋水仙素不同處理時(shí)間下各變量的多重比較

表3 秋水仙素不同處理濃度下各變量的多重比較

秋水仙素是一種作用于微管的特異性生物堿,秋水仙素能抑制有絲分裂,破壞紡錘體,使染色體停滯在分裂中期.秋水仙素有劇毒,處理太長時(shí)間會(huì)對(duì)處理的植物產(chǎn)生毒害作用,但秋水仙素不論是破壞還是抑制紡錘體的形成,作用都是一時(shí)的,去除秋水仙素后細(xì)胞可以恢復(fù)正常的分裂[21].從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,當(dāng)秋水仙素處理濃度一定時(shí),植株細(xì)胞加倍率會(huì)隨處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升的趨勢,在處理時(shí)間一定時(shí),細(xì)胞染色體的加倍率會(huì)隨濃度的上升而呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,所以應(yīng)權(quán)衡誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)濃度之間的平衡,選擇最適宜的組合進(jìn)行處理.

本實(shí)驗(yàn)中秋水仙素溶液處理蠶豆胚根的最佳濃度是0.100%,最佳時(shí)間是48 h.這是因?yàn)榍锼伤貙?duì)植株細(xì)胞有一定的毒害作用,誘導(dǎo)濃度過大或誘導(dǎo)時(shí)間過長都會(huì)影響到植株的正常生長,既不會(huì)誘導(dǎo)發(fā)芽,也不會(huì)誘導(dǎo)膨大.多倍體誘導(dǎo)的細(xì)胞學(xué)鑒定表明染色體會(huì)加倍,在二倍體的基礎(chǔ)上出現(xiàn)了四倍體和八倍體.這是因?yàn)榍锼伤匾种屏思忓N絲的形成,導(dǎo)致染色體不能移向兩級(jí),故出現(xiàn)了染色體加倍的情況[21].表型特征反映遺傳特征,表型變異特征可作為鑒定的一個(gè)形態(tài)學(xué)指標(biāo)來反映遺傳特征[22].用秋水仙素處理后,保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)量減少,體積變大,這是因?yàn)榍锼伤卣T導(dǎo)染色體加倍,細(xì)胞核的體積增大,各種細(xì)胞器也隨之增大,故保衛(wèi)細(xì)胞增大.秋水仙素濃度過高時(shí)會(huì)抑制胚根的形成和發(fā)育從而影響胚根的數(shù)量,而胚根的數(shù)量和植物吸收礦質(zhì)元素息息相關(guān),會(huì)影響到植株的生長發(fā)育.處理組的苗高和胚根數(shù)量明顯低于空白組,是因?yàn)橛行埩粼诮M織內(nèi)的秋水仙素比較容易向植物分生組織中運(yùn)輸積累,抑制了莖的分生生長.但是這些形態(tài)變異是否會(huì)影響到多倍體植株的生殖發(fā)育,是否能形成穩(wěn)定的多倍體后代,仍需進(jìn)一步研究.

參考文獻(xiàn):

[1]康向陽.林木多倍體育種研究進(jìn)展[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,25(4):71-74.

[2]雷家軍,王沖.觀賞植物多倍體誘導(dǎo)研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,43(1):18-24.

[3]李云,馮大領(lǐng).木本植物多倍體育種研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào),2005,22(3):375-382.

[4]趙陽,黃韜.秋水仙素在園藝植物多倍體育種中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].上海蔬菜,2010(2):29-31.

[5]閆輝,張利,于淑惠,等.秋水仙素誘導(dǎo)白皮松多倍體的研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,43(2):184-188.

[6]常青云,朱莉思,曹鑫,等.多因素對(duì)秋水仙素誘導(dǎo)多倍體效率的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(37):9863-9866.

[7]閆秋潔,楊瓊.秋水仙素對(duì)蠶豆胚根生長的影響及多倍體誘導(dǎo)效應(yīng)分析[J].廣西植物,2012,32(5):386-391.

[8]黃永蓮,胡木.秋水仙素對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞的誘變效應(yīng)[J].亞熱帶植物科學(xué)學(xué)報(bào),2005,34(1):4245.

[9]李政,黃靜潔,李凌.秋水仙堿誘變綠玉樹多倍體研究[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào),2007,29(2):107-109.

[10]郭英,梁國魯.小葉綠蘿同源多倍體誘導(dǎo)研究初報(bào)[J].西南農(nóng)藝,2002,30(4):1-3.

[11]胡洲鶴,覃子海,蔡玲.秋水仙索誘導(dǎo)桉樹多倍體的初步研究[J].廣西林業(yè)科學(xué),2004,33(4):195-203.

[12]陳高,孫衛(wèi)邦.秋水仙素誘導(dǎo)七里香多倍體[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(2):229-231.

[13]鄭寶強(qiáng),張瑩,王雁,等.春石斛的多倍體誘導(dǎo)[J].園藝學(xué)報(bào),2009,36(9):1381-1384.

[14]陳發(fā)棣,蔣甲福,房偉民.秋水仙素誘導(dǎo)菊花多倍體的研究[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2002,18(1):46-50.

[15]閻志紅,劉文革,趙勝杰,等.利用二硝基苯胺類除草劑離體誘導(dǎo)西瓜四倍體[J].園藝學(xué)報(bào),2008,35(11):1621-1626.

[16]王鴻鶴,葛欣,徐啟江,等.秋水仙堿誘導(dǎo)重瓣大巖桐多倍體的研究[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào),1999,7(3):237 242.

[17]李曉艷,張志東,李亞東,等.秋水仙素誘導(dǎo)離體培養(yǎng)越橘多倍體研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,41(1):38-42.

[18]陳紹潘,陳紹裘,楊英華,等.秋水仙堿誘變甜菊多倍體的研究[J].武漢植物學(xué)研究,1995,13(1):1-3.

[19]匡全,梁國魯,郭啟高,等.秋水仙素誘導(dǎo)牛蒡多倍體[J].植物生理學(xué)通訊,2004,40(2):157-158.

[20]張素芝,李紀(jì)蓉.秋水仙素誘導(dǎo)大蒜四倍體的研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2006,20(4):303-308.

[21]楊小青.關(guān)于秋水仙素作用機(jī)理的初步探討[J].中學(xué)生物教學(xué),2004(6):52.

[22]王麗艷,梁國魯.植物多倍體的形成途徑及鑒定方法[J].北方園藝,2004(1):61-62.