甲狀腺乳頭狀癌中HER-2、CyclinD1 的表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

羅思佳，李漢軍，葉家欣，高友兵

（湖北武漢市廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院，武漢 430070）

甲狀腺乳頭狀癌（Papillary Thyroid Cancer，PTC）是一種內(nèi)分泌系統(tǒng)最覺見的惡性腫瘤，約占甲狀腺癌的80%，近年來，其發(fā)病率呈現(xiàn)急劇增長的態(tài)勢［1-3］。多數(shù)PTC 可通過手術(shù)的方法進(jìn)行治療，且預(yù)后良好，死亡率低。早期診斷是PTC 的治療關(guān)鍵，近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)水平的迅速發(fā)展，采用基因技術(shù)對PTC 進(jìn)行早期診斷成為研究熱點。一些研究證實，HER-2/neu癌基因在乳腺癌和胃癌臨床診斷治療中有重要意義［4］，但HER-2 在PTC 上的表達(dá)狀況卻少有研究［5］；目前雖然已有用CyclinD1 表達(dá)狀況作為PTC 中的病理診斷指標(biāo)，但研究結(jié)果尚不一致［6，7］，仍需進(jìn)一步驗證。

1 資料與方法

1.1 材料來源收集廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院病理科自2011 年1 月1 日至2013 年12 月31 日存檔的PTC 手術(shù)病例組織蠟塊標(biāo)本85 例為實驗組，甲狀旁腺腫及瘤旁正常組織標(biāo)本85 例為對照組。實驗組患者年齡26～75歲，平均56 歲，其中男性28 人，女性57 人；其中微小癌17 例，彌溫硬化型18 例，高細(xì)胞型19 例，嗜酸細(xì)胞型4 例，彌漫硬化型15 例，包裹型17 例；發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31 例；按照AJCC 制定的2002 年版甲狀腺癌的TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，I 期36 例，II 期33 例，III 期16 例。對照組患者年齡30～79 歲，平均51 歲，其中甲狀腺濾泡性腺瘤31 例，慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎9 例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫40 例，甲狀腺嗜酸細(xì)胞瘤5 例。

1.2 病例納入排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者手術(shù)前均未行內(nèi)、外放射治療；標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)病理診斷確診；PTC 初次切除術(shù)后原發(fā)灶無癌殘留。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后復(fù)發(fā)病例標(biāo)本；有遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移病例標(biāo)本；初次手術(shù)后原發(fā)灶有癌殘留者。

1.3 試劑與方法即用型HER-2 鼠抗人單克隆抗體（克隆號CB11），購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；CyclinD1 單抗（克隆號SP4），購自武漢博士德生物工程有限公司。采用免疫組化方法為石蠟包埋切片為5 μm連續(xù)切片，裱于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，56℃烤片3 小時后，37℃恒溫箱中過夜，置于-20℃冰箱中待用。免疫組化染色采用Envision 兩步法檢測HER-2 和CyclinD1 蛋白表達(dá)，按試劑盒說明書操作，使用已知陽性切片（HER-2）和血管內(nèi)皮細(xì)胞（CyclinD1）作為陽性對照，PBS 代替一抗為陰性對照。

1.4 判讀標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 HER-2 在PTC 中的判讀標(biāo)準(zhǔn)由于尚未有公認(rèn)的甲狀腺癌中HER-2 的判讀標(biāo)準(zhǔn)，參考胃癌和乳腺癌的HER-2 判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，將PTC 中免疫組化檢測出的HER-2（++，+++）定為陽性。⑴陰性: 無著色；⑵HER-2(+)；任何比例的PTC 癌細(xì)胞呈現(xiàn)微弱細(xì)胞膜著色；⑶ HER-2(++）：>10%的PTC 癌細(xì)胞呈現(xiàn)弱至中等強(qiáng)度的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性的細(xì)胞膜棕黃著色或<30%的PTC 癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)的基底側(cè)膜，側(cè)膜或完全性的細(xì)胞膜棕黃著色；⑷HER-2(+++)：>30%的PTC 癌細(xì)胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜強(qiáng)棕黃著色。

1.4.2 CyclinD1 在PTC 中的判讀標(biāo)準(zhǔn)CyclinD1 蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核或胞漿陽性信號為呈棕色或棕褐色細(xì)顆粒狀。在同一光強(qiáng)亮度下，陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)參照 Takahashi 等的方法，同一高倍鏡下（×400 倍）每張切片隨機(jī)選取 10 個視野進(jìn)行拍照計數(shù)，根據(jù)染色程度和著色細(xì)胞百分率進(jìn)行半定量結(jié)果判斷：胞核或者胞漿基本不著色記 0 分，陽性細(xì)胞按染色淡黃色、棕黃色、棕褐色依次記為 1~3 分；著色細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞百分率≤5%記 0 分，6%~25%記 1 分，26%~50%記 2 分，>50%記 3 分，兩項得分乘積作為最后判斷結(jié)果：評分，分值<2 者為染色陰性，分值≥2 者為染色陽性。

1.5 統(tǒng)計方法利用Microsoft EXCEL 建立數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料選擇t 檢驗或秩和檢驗；計數(shù)資料選擇秩和檢驗或χ2檢驗；相關(guān)分析采用spearman 等級相關(guān)。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 實驗組與對照組HER-2 和CyclinD1 的表達(dá)情況HER-2 陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，鏡下顯示為主要在基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性的細(xì)胞膜呈棕黃色，其中部分胞質(zhì)著色。表1 顯示，85 例實驗組中有44 例出現(xiàn)陽性表達(dá)，陽性率為51.76%；對照組中未見陽性表達(dá)，兩組間HER-2 蛋白表達(dá)情況差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-8.71，P<0.001）。CyclinD1 陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，實驗組85 例PTC 中有70 例出現(xiàn)陽性表達(dá)，陽性率為82.35%；對照組無陽性表達(dá)，兩組CyclinD1 表達(dá)情況差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=119.00，P<0.001）。

表1 實驗組和對照組HER-2、CyclinD1蛋白的表達(dá)情況

2.2 實驗組中HER-2、CyclinD1 蛋白表達(dá)的相關(guān)情況表2 中顯示，實驗組中HER-2 與CyclinD1 聯(lián)合表達(dá)情況，85 例中有5 例HER-2 和CyclinD1 蛋白均無表達(dá)，兩蛋白表達(dá)情況無相關(guān)性（r=-0.021，P=0.846）。

表2 實驗組中HER-2和CyclinD1蛋白的表達(dá)情況（n）

表3 不同臨床病理參數(shù)中HER-2、CyclinD1蛋白的表達(dá)情況（n）

2.3 頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與HER-2、CyclinD1 蛋白的表達(dá)情況其中，性別、年齡、腫瘤直徑與兩種蛋白的表達(dá)無關(guān)（P>0.05），PTC 實驗組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與HER-2蛋白表達(dá)無關(guān)（Z=-1.36，P=0.173），但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CyclinD1 蛋白陽性率（96.43%）高于非轉(zhuǎn)移組（74.47%）（χ2=4.47，P=0.034），詳見表3。

3 討論

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)水平的迅速發(fā)展，基因突變與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展及臨床病理學(xué)因素的相關(guān)性研究已經(jīng)成為研究熱點。

HER-2 蛋白在乳腺癌中表達(dá)的檢測以及相關(guān)藥物的治療已廣泛應(yīng)用于臨床，現(xiàn)又逐漸應(yīng)用于胃癌的檢測及治療中［7］，而該蛋白與PTC 的關(guān)聯(lián)研究較少。本實驗通過免疫組化方法對75 例 PTC 進(jìn)行HER-2 蛋白檢測，發(fā)現(xiàn)HER-2 蛋白在PTC 中陽性表達(dá)多定位于細(xì)胞膜的底側(cè)膜或側(cè)膜，部分也存在完全性細(xì)胞膜著色。由于尚未有公認(rèn)的甲狀腺癌中HER-2 的判讀標(biāo)準(zhǔn)，參考胃癌和乳腺癌的HER-2 判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，將PTC 中免疫組化檢測出的HER-2（++，+++）定為陽性。研究顯示，實驗組中有39 例患者HER-2 表達(dá)陽性，陽性率為51.76%，對照組未見陽性表達(dá)，兩組間HER-2 蛋白表達(dá)情況差異有統(tǒng)計學(xué)意義。此結(jié)果與張曉亮［7］研究一致。由此推測，HER-2 蛋白的表達(dá)是PTC 發(fā)生發(fā)展的重要因素，可以作為評估PTC 的獨立的危險因素，其臨床治療的價值值得進(jìn)一步深入探討。

CyclinD1 蛋白是G1 期細(xì)胞周期素，可以驅(qū)使細(xì)胞由G1 期進(jìn)入S 期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。1991 年由 Motokura等在研究甲狀旁腺時首先分離該蛋白，并發(fā)現(xiàn)正常情況下，CyclinD1 蛋白在G1 期只是呈一過性表達(dá)，但當(dāng)CyclinD1 蛋白表達(dá)失控時，則會引起細(xì)胞增殖周期失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［8］。近年來大量研究證實，CyclinD1 作為候選癌基因已參與多種實體瘤的分子病理機(jī)制，是目前公認(rèn)的癌基因［8-10］。本研究中，85 例PTC 患者中有70 例出現(xiàn)陽性表達(dá)，陽性率達(dá)到82.35%；對照組無陽性表達(dá)，兩組間CyclinD1 表達(dá)情況差異有統(tǒng)計學(xué)意義,研究結(jié)果與馮云報道一致［8］。由此推測，CyclinD1 蛋白的異常表達(dá)與PTC 密切相關(guān)，也可以作為評估PTC 的獨立危險因素。

本次研究未發(fā)現(xiàn)HER-2 與 CyclinD1 存在顯著相關(guān)關(guān)系，雖然有研究證實HER-2 激活后可以影響CyclinD1 的表達(dá)［11］，但是本研究結(jié)果顯示兩者陽性率差別較大（分別為51.76%和82.35%），不存在顯著相關(guān)關(guān)系，因此推測HER-2 只是影響CyclinD1 表達(dá)的一個因素，還存在其他未知因素影響CyclinD1 表達(dá)。

本次研究通過對性別、年齡、腫瘤直徑以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等基本病理，對兩種蛋白表達(dá)情況進(jìn)行比較分析。其中性別、年齡、腫瘤直徑與兩種蛋白的表達(dá)無關(guān)，PTC實驗組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與HER-2 蛋白表達(dá)無關(guān)，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CyclinD1 蛋白陽性率高于非轉(zhuǎn)移組，與劉澤兵［6］，甘世新［12］等研究報道一致，由此推測過表達(dá)CyclinD1 的腫瘤組織更具有侵襲力，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高。

本研究結(jié)果顯示HER-2 蛋白與 PTC 密切相關(guān)，CyclinD1 蛋白不僅與 PTC 有關(guān)，還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)關(guān)系。因此，研究推測 HER-2 和CyclinD1 蛋白對于PTC 診斷具有一定意義，其臨床治療價值值得進(jìn)一步深入探討。兩蛋白與PTC 患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移危險因素的評估方面，發(fā)現(xiàn)CyclinD1 蛋白的表達(dá)與PTC 的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示CyclinD1 蛋白可能是 PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素，CyclinD1 蛋白表達(dá)陽性的PTC 患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性越大，而二者的關(guān)聯(lián)需要進(jìn)一步在大樣本人群研究中驗證。

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