MMP-9 和TGFβ1 在宮頸鱗癌中的表達(dá)和意義

沈浩明，楊友義，吳白平，向延娥

（1.湖南省腫瘤醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410013；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 41000）

宮頸癌是婦女中常見的惡性腫瘤，每年全世界大約有37 萬新發(fā)病例，在宮頸癌患者中大約有51%死亡。宮頸癌是婦女死于惡性腫瘤的重要原因之一，是繼乳腺癌之后居第二位的惡性腫瘤。因此，宮頸癌是嚴(yán)重危害婦女健康的疾病之一。

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的過程，其中細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解被認(rèn)為是腫瘤侵襲正常組織和開始轉(zhuǎn)移的信號(hào)和重要途徑。研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的重塑是癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需借助蛋白降解酶的表達(dá)和激活。已證實(shí)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)的基質(zhì)降解酶有兩大類：蛋白酶類和糖苷酶類。目前所知的蛋白降解酶類有絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）。MMPS 是一組重要的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，它通過對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)不同成分的降解，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。MMP-9 是MMPS 家族中的重要成員，能降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分IV 型膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白，被認(rèn)為與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）是普遍存在的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子，在生理狀態(tài)下，對(duì)細(xì)胞增殖、分化、遷移、血管生成、免疫監(jiān)視等起重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用；而在腫瘤中，TGF-β1 卻表現(xiàn)出雙重作用，在腫瘤早期，TGF-β1 可抑制腫瘤生長(zhǎng)，隨著腫瘤的進(jìn)展，TGF-β1可干擾機(jī)體免疫功能，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。TGF-β 1 參與調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子的表達(dá)。HPV 相關(guān)的宮頸癌的重要形成機(jī)制之一是TGF-β1 的改變，但是目前TGF-β1 在宮頸癌中的表達(dá)情況存在爭(zhēng)議。

本實(shí)驗(yàn)擬采用ELISA 和免疫組化的方法檢測(cè)宮頸分泌物、血清和宮頸病變組織中的TGF-βl 和MMP-9表達(dá)情況，探討其與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，并分析幾種檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 ELISA 試劑與儀器（1）試劑 美國(guó)Groundwork Biotechnology Diagnosticate 公司Matrix Metalloproteinase 9 ELISA 試劑盒 （批號(hào)：LOT#M064-00 EXP 2011 Mar）美國(guó)Groundwork Biotechnology Diagnosticate 公司Transforming Growth Factor β1 ELISA 試劑盒 （批號(hào)：LOT#T024-00 EXP 2011 Mar） （2）主要儀器 TDL4-2低速臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀貝克儀器儀表有限公司）FX1800-II-B2 型生物安全柜（上海瑞仰凈化設(shè)備有限公司）ELX800 酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）及寶特800 酶聯(lián)系統(tǒng)軟件HH·BII·360BS-II 型恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）HH·W21·Cr600II 型臺(tái)式電子恒溫水溫箱（汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠有限公司）2ul、10ul、50ul、100ul、200ul 移液器各一把（賽默飛世爾上海儀器有限公司）

1.1.2 免疫組化試劑與儀器（1）試劑 鼠抗人MMP-9 單克隆抗體工作液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司貨號(hào)100301014B 產(chǎn)地北京）鼠抗人TGF-β1 單克隆抗體工作液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司貨號(hào)100301012B 產(chǎn)地北京）中性樹膠（上海華申康復(fù)器材有限公司貨號(hào)20091213 產(chǎn)地上海）多聚賴氨酸（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）SP-9002 鼠SP Kit 試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司貨號(hào)10050713 產(chǎn)地北京）DAB 顯色劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）蘇木素復(fù)染液、二甲苯、乙醇等化學(xué)試劑檸檬酸緩沖液（pH6.0）磷酸鹽緩沖液（PBS：pH7.4）（2）儀器 石蠟切片機(jī)奧林巴斯生物顯微鏡；病理圖文分析系統(tǒng)；推片烤片機(jī)；電熱恒溫箱；電冰箱；其他：不銹鋼壓力鍋、染片缸、染片盒、微量移液器、載玻片及蓋玻片等。

1.2 材料來源

1.2.1 血清和宮頸分泌物標(biāo)本湖南省腫瘤醫(yī)院66 例婦科腫瘤病房病人宮頸分泌物和血清標(biāo)本。其中慢性宮頸炎組織10 例、CIN（cervical intraepithelial neoplasia 宮頸上皮內(nèi)瘤變）24 例，宮頸鱗癌32 例。所有病例術(shù)前均未經(jīng)放療或化療。宮頸分泌物采用一次性專用刷，刷取宮頸分泌物保存于0.5 mL 生理鹽水中，以1000rpm/min離心后取上清液保存于-70℃冰箱凍存?zhèn)錅y(cè)。

研究對(duì)象均于清晨空腹肘靜脈抽血5 mL，靜置半小時(shí)，于4000 轉(zhuǎn)/分離心5 分鐘分離血清，裝于干凈的聚丙烯管中，貼好標(biāo)簽，置于-70℃冰箱凍存?zhèn)錅y(cè)。

1.2.2 免疫組化標(biāo)本收集湖南省腫瘤醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的宮頸組織標(biāo)本，其中慢性宮頸炎組織10 例、 CIN24例，宮頸鱗癌（CxCa）32 例。所有病例術(shù)前均未經(jīng)放療或化療，病理診斷均由兩名病理醫(yī)師證實(shí)。所有標(biāo)本均經(jīng)10%的甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 um 厚連續(xù)切片。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ELISA 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理：先將抗體包被于酶聯(lián)板上，同時(shí)加入待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本和酶標(biāo)的小分子，溫育一定時(shí)間后，洗板；此步中，待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本將與酶標(biāo)小分子競(jìng)爭(zhēng)與固相上特異抗體結(jié)合。加入酶底物，溫育，顯色測(cè)定，顯色的強(qiáng)弱與待測(cè)樣本中的小分子含量成反比。

實(shí)驗(yàn)步驟：（1）取出試劑盒，于室溫（20~25℃）放置15～30 分鐘。（2）取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入100 μL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于6 個(gè)微孔中（標(biāo)準(zhǔn)品組）。樣品組中加入100 μL 的樣品，空白對(duì)照組加入100 μL 的蒸餾水，孵育并加入酶標(biāo)抗體反應(yīng)。（3）用清洗液充分清洗酶標(biāo)板3~5 次，（4）酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙徹底拍干。（5）各孔加入顯色劑A、B 液各50 μL。（6）20~25℃下避光反應(yīng)15 分鐘。（7）各孔加入50 μL 終止液，終止反應(yīng)。

結(jié)果判斷：將酶標(biāo)板于酶標(biāo)儀檢測(cè)（采用450 nm 和630 nm 雙波長(zhǎng)檢測(cè)）各孔OD 值，運(yùn)用寶特800 酶聯(lián)系統(tǒng)軟件采用二次曲線擬合方法換算出各孔濃度。

1.3.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色法采用SP 染色法標(biāo)本經(jīng)100 mL/L 福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚5 μm，并行常規(guī)HE 染色經(jīng)病理科專家閱片復(fù)診。免疫組織學(xué)SP 法按試劑盒說明書進(jìn)行。組織切片脫蠟至水，PBS 緩沖液振洗3 min×3；置于耐高溫切片架上，放入已沸騰的高壓鍋中進(jìn)行組織抗原熱修復(fù)，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣，從噴氣開始計(jì)時(shí)，2 min 后壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫，取出玻片，蒸餾水沖洗兩次，PBS 液振洗3 min×3；30 mL/L H2O2去離子水消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫下孵育10 min，PBS 緩沖液振洗3 min×3；正常山羊血清封閉，室溫孵育15 min；加適當(dāng)比例稀釋的第一抗體，37℃孵育2 h，PBS 緩沖液振洗3 min×3；加生物素標(biāo)記的第二抗體，37℃孵育15 min，PBS 緩沖液振洗3 min×3；加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，PBS 緩沖液振洗3 min×3；DAB 顯色，蘇木素淺染，脫水，封片，鏡檢。

結(jié)果判斷：TGF-β1 陽性表達(dá)為細(xì)胞胞膜和（或）胞漿上呈現(xiàn)深棕色顆粒；MMP-9 陽性表達(dá)為細(xì)胞漿中呈現(xiàn)棕色或深棕色顆粒。采用半定量結(jié)果判斷，陽性著色強(qiáng)度：無色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；陽性著色細(xì)胞數(shù)：每張切片上觀察5 個(gè)高倍視野（×200），計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1 分，11%-50%為2 分，51%-100%為3 分。將著色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比分值相加，0-2 分為陰性（-），3分為弱陽性（+），4 分為輕度陽性（++），5-6 分為（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS16.0 進(jìn)行單因素方差分析比較多組均數(shù)的差異，并進(jìn)行相關(guān)與回歸分析判斷TGF-β1 與MMP-9 表達(dá)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 慢性宮頸炎、CIN 組和CxCa 組患者血清和宮頸分泌物標(biāo)本MMP-9 和TGF-β1 含量的ELISA 檢測(cè)結(jié)果宮頸分泌物中MMP-9 在慢性宮頸炎、CIN 組和CxCa 組的平均濃度分別為1.28±0.34ng/ mL、2.44±0.68ng/ mL 和8.05±1.09ng/ mL，CIN 組和CxCa 組與慢性宮頸炎相比明顯升高，（P<0.01），而CxCa 組與CIN 組相比，宮頸分泌物中MMP-9 的表達(dá)也明顯升高（8.05±1.09ng/ mL vs 2.44±0.68ng/ mL，P<0.01），表明隨著宮頸癌惡性程度的增加，MMP-9 的表達(dá)明顯增強(qiáng)。而血清中MMP-9 在慢性宮頸炎、CIN 組和CxCa 組的平均濃度分別為6.42±0.82ng/ mL，7.25±1.02ng/ mL 和13.76+2.98ng/ mL，各組間的MMP-9 表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P<0.01），表明隨著宮頸癌惡性程度的增加，MMP-9 的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而且可以看出在宮頸分泌物中MMP-9 的平均濃度增高更為明顯。

宮頸分泌物中TGF-β1 在慢性宮頸炎、CIN 組和CxCa 組的平均濃度分別為47.7±8.32pg/ mL、100.3±17.98pg/ mL 和243.3±27.62pg/ mL，CIN 組和CxCa 組與慢性宮頸炎相比統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P<0.01），而CxCa 組與CIN 組相比，宮頸分泌物中的TGF-β1 表達(dá)也明顯升高（243.3±27.62pg/ mL vs 100.3±17.98pg/mL，P<0.01），表明隨著宮頸癌惡性程度的增加，TGF-β1 的表達(dá)與MMP-9 一樣明顯增強(qiáng)。而血清中TGF-β 1 在慢性宮頸炎、CIN 組和CxCa 組的平均濃度分別為202.3±13.70pg/ mL，237.4±26.88pg/ mL 和366.2±21.50pg/ mL，各組間的TGF-β1 表達(dá)水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P<0.01），表明隨著宮頸癌惡性程度的增加，TGF-β1 表達(dá)明顯增強(qiáng)，而且可以看出在宮頸分泌物中TGF-β1 的平均濃度增高更為明顯。

表1 慢性宮頸炎、CIN和CxCa患者宮頸分泌物和血清中MMP-9和TGF-β1的表達(dá)

2.2 慢性宮頸炎、CIN 組和CxCa 組患者宮頸組織樣本MMP-9 和TGF-β1 表達(dá)的免疫組化結(jié)果MMP-9 陽性率從慢性宮頸炎組（圖1C）、CIN 組（圖1B）到CxCa 組逐級(jí)升高（圖1A），66 例樣品的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2，并且利用ELISA 方法檢測(cè)的宮頸分泌物中MMP-9濃度與其切片免疫組化陽性率的基本吻合，兩種檢測(cè)方法都顯示出，隨著宮頸癌惡性程度的增加，MMP-9的表達(dá)明顯增強(qiáng)。

圖1 MMP-9陽性率從慢性宮頸炎組、CIN組到CxCa組逐級(jí)升高

圖2 TGF-β1陽性率從慢性宮頸炎組、CIN組到CxCa組逐級(jí)升高

表2 MMP-9在慢性宮頸炎組、CIN組和宮頸癌組中的表達(dá)情況

Chi-squre=13.14 P=0.0014 ＜0.01，認(rèn)為免疫組化檢測(cè)組織中mmp-9 水平在慢性宮頸炎組、CIN 組和宮頸癌組中的表達(dá)有顯著差異，并且陽性率逐級(jí)增高。

利用TGF-β1 特異性抗體進(jìn)行免疫組化的結(jié)果顯示，表達(dá)TGF-β1 的細(xì)胞從慢性宮頸炎組（圖2C）、CIN組（圖2B）到CxCa 組逐級(jí)升高（圖2A），66 例樣品的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3，并且利用ELISA 方法檢測(cè)的宮頸分泌物中TGF-β1 濃度與其切片免疫組化陽性率的基本吻合，兩種檢測(cè)方法都顯示出，隨著宮頸癌惡性程度的增加，TGF-β1 的表達(dá)明顯增強(qiáng)。

表3 TGFβ1在慢性宮頸炎組、CIN組和宮頸癌組中的表達(dá)水平

Chi-squre=15.82 P=0.0004 ＜0.01 認(rèn)為免疫組化檢測(cè)組織中TGF-β1 水平在慢性宮頸炎組、CIN 組和宮頸癌組中的表達(dá)有顯著差異，并且陽性率逐級(jí)增高。

2.3 MMP-9 和TGF-β1 在宮頸分泌物和血清中表達(dá)的相關(guān)性在前面的結(jié)果中顯示TGFβ1 與MMP-9 的表達(dá)均隨著腫瘤惡性化程度逐級(jí)升高，提示TGF-β1和MMP-9 的表達(dá)可能存在一定的聯(lián)系，綜合分析66個(gè)樣品的TGF-β1 和MMP-9 的表達(dá)之間的相關(guān)性（不考慮分組）。圖3 顯示的是66 例樣品中宮頸分泌物TGF-β1 表達(dá)情況，圖4 顯示的是66 例樣品中宮頸分泌物MMP-9 表達(dá)情況，對(duì)宮頸分泌物中的TGF-β1 與MMP-9 表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者呈顯著的正相關(guān)（圖5），相關(guān)系數(shù)（r）=0.374，P<0.01。

利用同樣的方法分析血清中TGF-β1 與MMP-9 的表達(dá)的相關(guān)性，圖6 顯示的是66 例樣品中血清TGF-β1表達(dá)情況，圖4 顯示的是66 例樣品血清中MMP-9 表達(dá)情況，對(duì)血清的TGF-β1 與MMP-9 表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示血清中TGF-β1 與MMP-9 表達(dá)水平同樣具有顯著的正相關(guān)（圖5），相關(guān)系數(shù)（r）=0.643，P<0.01。

圖3 66例樣品宮頸分泌物中TGFβ1的表達(dá)水平

圖4 66例樣品宮頸分泌物中MMP-9的表達(dá)水平

圖5 宮頸分泌物中TGF-β 1與MMP-9表達(dá)的相關(guān)性曲線

圖6 66例樣品血清中TGF-β1的表達(dá)水平

圖7 66例樣品血清中MMP-9的表達(dá)水平

圖8 血清中TGF-β1與MMP-9表達(dá)的相關(guān)性曲線

2.4 MMP-9 和TGF-β1 與宮頸癌各臨床病理因素的關(guān)系（表4）分析32 例宮頸癌標(biāo)本（CxCa 組）中MMP-9 和TGF-β1 表達(dá)情況與宮頸癌各臨床病理因素的關(guān)系，研究涉及的臨床病理因素包括腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、有無淋巴轉(zhuǎn)移以及臨床分級(jí)等。結(jié)果如表4 所示，其中TGF-β1 表達(dá)陽性率在腫瘤大小<5CM的樣品與腫瘤大小>5CM 的標(biāo)本中，沒有顯著性差異（57.1% vs 66.6%，P>0.05），MMP-9 表達(dá)陽性率在腫瘤大小不同組中也不具有顯著的差異（71.4% vs 61.1%，P>0.05）。在組織學(xué)分級(jí)不同的組中，TGF-β 1 或MMP-9 表達(dá)陽性率也沒有顯著性的差異（P>0.05）。但是對(duì)于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本，其TGF-β1 的表達(dá)陽性率顯著低于有轉(zhuǎn)移的組（50% vs 86.4%，P<0.05），并且在兩組中MMP-9 表達(dá)的陽性率變化與TGF-β1 一致。在宮頸癌≥Ⅱb 期的TGFβ1 和MMP-9 的表達(dá)陽性率顯著高于≤Ⅱa 期的（TGF-β1：82.6% vs 44.4%，P<0.05；MMP-9：87% vs 55.5%，P<0.05）。

綜合以上結(jié)果，可以看出宮頸癌標(biāo)本（CxCa 組）中MMP-9 和TGF-β1 表達(dá)情況與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及癌癥臨床分期具有一定的聯(lián)系，MMP-9 和TGF-β1 表達(dá)可能促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤進(jìn)一步惡化，MMP-9 和TGF-β1表達(dá)檢測(cè)可能成為監(jiān)測(cè)宮頸癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。

表4 MMP-9和TGF-β1與宮頸癌各臨床病理因素的關(guān)系

3 討論

宮頸癌（cervical carcinoma）是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。一般認(rèn)為其發(fā)生是宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）至宮頸癌的連續(xù)過程。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞能與基底膜（BM）表面受體結(jié)合，釋放各種水解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracelluiar matrix，ECM），瘤細(xì)胞伸出偽足并向被蛋白酶降解的區(qū)域運(yùn)動(dòng)，從而形成轉(zhuǎn)移灶。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是一種重要的ECM 降解酶，甚至在BM 未被降解和未出現(xiàn)惡性病變時(shí)，腫瘤組織中已發(fā)現(xiàn)MMP 的表達(dá)上調(diào)并活化［1］?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是MMP 家族中的重要一員。宮頸癌中TGF-β1 的表達(dá)說法不一，但大多數(shù)研究表明，TGF-β1 在宮頸癌中呈現(xiàn)過度表達(dá)。Hazelbag 等［2］和Farley 等［3］的研究都發(fā)現(xiàn)宮頸癌中TGF-β1 過度表達(dá)。

3.1 基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）簡(jiǎn)介及其作用基質(zhì)金屬蛋白酶是一個(gè)大家族，因其需要Ca++、Zn++等金屬離子作為輔助因子而得名，其家族成員具有相似的結(jié)構(gòu)，一般由5 個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域組成：（1）疏水信號(hào)肽序列；（2）前肽區(qū)，主要作用是保持酶原的穩(wěn)定。當(dāng)該區(qū)域被外源性酶切斷后，MMPs 酶原被激活；（3）催化活性區(qū)，有鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)酶催化作用的發(fā)揮至關(guān)重要；（4）富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)；（5）羧基末端區(qū)，與酶的底物特異性有關(guān)。其中酶催化活性區(qū)和前肽區(qū)具有高度保守性［8］。MMPs 成員上述結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上各有特點(diǎn)。各種MMP 間具有一定的底物特異性，但不是絕對(duì)的。同一種MMP 可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成份，而某一種細(xì)胞外基質(zhì)成分又可被多種MMP 降解，但不同酶的降解效率可不同。MMPs 幾乎能降解ECM 中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用，從而在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用日益受到重視，被認(rèn)為是該過程中主要的蛋白水解酶。目前MMPs家族已分離鑒別出26 個(gè)成員，編號(hào)分別為MMP1～26。根據(jù)作用底物以及片斷同源性，將MMPs 分為4 類。Ⅳ型膠原酶為其中重要的一類，它主要有兩種形式，一種被糖化，分子量為92kD，命名為MMP-9［9］。

MMP-9 又稱Ⅳ型膠原酶或明膠酶B，是由多種細(xì)胞分泌的糖化蛋白。人類MMP-9 在MMP 家族中分子量最大，其基因位于染色體20ql2-q13。MMP-9 基因的正常表達(dá)能調(diào)控和維持正常組織功能。MMP-9 在多種惡性腫瘤中呈過度表達(dá)［4］，其調(diào)控作用消失，可能成為腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的原因。腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，MMP-9 通過降解ECM，形成局部溶解區(qū)，構(gòu)成腫瘤細(xì)胞移動(dòng)的通道［5］。此外，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的MMP-9，還參與腫瘤的血管生成［6］。MMP-9 在降解BM 糖蛋白及ECM 的同時(shí)能對(duì)ECM 進(jìn)行改建，為新的血管生長(zhǎng)提供空間，有助于新的血管形成［7］。隨MMP-9 表達(dá)的增強(qiáng)，腫瘤的血管生成能力顯著增加［8］。

3.2 MMP-9 與惡性腫瘤惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程。MMPs 在腫瘤轉(zhuǎn)移中有如下作用：第一，破壞局部組織結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)；第二，破壞基底膜屏障，有利于腫瘤的轉(zhuǎn)移；第三，通過對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的改建，促進(jìn)腫瘤新生血管的形成。腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的先決條件是對(duì)其周邊細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解。基底膜是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的屏障，其完整性是判定腫瘤細(xì)胞有無浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。腫瘤通過降解基底膜的IV 型膠原、層粘連蛋白、纖粘連蛋白質(zhì)直接侵襲臨近正常組織或穿過血管到達(dá)靶器官，在轉(zhuǎn)移部位呈惡性增生。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，水解IV 型膠原的MMP-9-在這一過程中起及其重要作用。Kabashima等［13］，報(bào)道，胃粘膜內(nèi)癌組織中MMP-9 的表達(dá)與癌細(xì)胞在淋巴管中的擴(kuò)散及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，推測(cè)MMP-9 在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為方面起關(guān)鍵性作用。Demeter 等［14］，研究了17 例上皮性卵巢癌，5 例良性卵巢腫瘤，5 例正常卵巢組織，5 例低度潛在惡性卵巢腫瘤，4 例性索間質(zhì)瘤以及2 例生殖細(xì)胞腫瘤，發(fā)現(xiàn)MMP-9 活性不存在于正常卵巢，上皮性卵巢癌MMP-9 水平高于良性卵巢腫瘤，MMP-9 活性在分化低、分期高的卵巢癌中表達(dá)明顯增高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性卵巢癌中MMP-9 明顯升高，說明MMP-9 高表達(dá)與臨床分期有關(guān)，且與患者預(yù)后密切相關(guān)。Sh-eu 等［15］采用免疫組織化學(xué)法研究發(fā)現(xiàn)，隨著宮頸癌病變程度的加重，MMP-9 的表達(dá)量不斷增加，且與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)。另外，在肝癌［16］、乳腺癌［18］、骨肉瘤［17］等多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)MMP-9 的高表達(dá)，且在臨床分期晚，組織分級(jí)低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的腫瘤中表達(dá)異常增高，MMP-9 可能與腫瘤的侵襲能力和惡性表型有關(guān)。

3.3 MMP-9 的表達(dá)與宮頸癌的關(guān)系MMP-9 在宮頸癌中的表達(dá)位于癌細(xì)胞的細(xì)胞漿［9-11］和／或細(xì)胞膜［11］，并且在癌細(xì)胞向間質(zhì)浸潤(rùn)最明顯處表達(dá)最強(qiáng)［9］，有的在宮頸癌周圍間質(zhì)成纖維細(xì)胞中由弱到中度陽性表達(dá)［9］。MMP-9 在宮頸癌中的表達(dá)高于宮頸炎組織與CIN 組，且隨著病程不斷進(jìn)展及病理分級(jí)的增加表達(dá)率呈上升趨勢(shì)［9］。關(guān)于MMP-9 表達(dá)率與宮頸癌癌細(xì)胞的分化程度的關(guān)系，文獻(xiàn)報(bào)道較不一致。有報(bào)道稱MMP-9 的表達(dá)率在高、中、低分化宮頸癌中無顯著性差異［10］，同時(shí)也有報(bào)道稱宮頸癌高分化組的MMP-9 的表達(dá)率明顯低于中低分化組［11］。MMP-9 的表達(dá)率與宮頸癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)［12］。

3.4 TGF-β1 的表達(dá)和宮頸癌的關(guān)系宮頸癌中TGF-β1 的陽性率比CIN 組和宮頸炎組顯著增高，提示TGF-β1 的高表達(dá)與宮頸癌密切相關(guān)?？赡芤?yàn)閷m頸癌細(xì)胞對(duì)高水平TGF-β 1 的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)產(chǎn)生耐受，敏感性降低。而癌細(xì)胞自身分泌的TGF-β1 又增加了局部免疫抑制作用，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)控。同時(shí)TGF-β1 的陽性率隨宮頸癌臨床分期的進(jìn)展而增高，而且TGF-β1 在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌中的陽性率顯著增高。另外隨著病理分級(jí)的增高，TGF-β1 的表達(dá)也逐漸增高。提示機(jī)體對(duì)TGF-β1 的抑制產(chǎn)生耐受后不僅不能抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，反而促進(jìn)其生長(zhǎng)，并增加惡性程度，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移?？梢奣GF-β1的過度表達(dá)導(dǎo)致了信號(hào)傳導(dǎo)通路的紊亂，使TGF-β1的抑制作用基本喪失。高水平的TGF-β1 在腫瘤局部“小環(huán)境”里積聚，甚至通過某種機(jī)制轉(zhuǎn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。我們認(rèn)為血清和宮頸分泌物TGF-β1 升高提示宮頸癌惡性程度的增加。

3.5 MMP-9 和TGF-β1 與宮頸癌的關(guān)系TGF-β1是MMP-9 的重要調(diào)節(jié)因子，其可在基因水平、酶原水平和組織抑制劑水平調(diào)控MMP-9 表達(dá)、分泌和活性，而TGF-β 1 活化也涉及到MMP-9 的酶解，可見TGF-β 1 和MMP-9 之間相互協(xié)調(diào)、相互制約，共同調(diào)控著腫瘤的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，隨著宮頸癌臨床分級(jí)的增加血清中和宮頸分泌物中的TGF-β 1 是MMP-9 程明顯上升趨勢(shì)，且與相應(yīng)病理切片所作的TGF-β1 和MMP-9 的免疫組化結(jié)果吻合。

綜上所述，TGF-β1 在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中影響著MMP-9 的表達(dá)，兩者均發(fā)揮促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的功能。

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