紫色胡蘿卜汁體外抗氧化活性的研究

虎春艷，林玉萍，魯 瑞，張春梅，羅興倩，梁 杏，趙聲蘭*

（1.云南中醫(yī)學院 藥學院，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)學院 中藥學院，云南 昆明 650500）

蘿卜是常見蔬菜之一，《本草綱目》記載，“蘿卜大下氣、消谷和中、去邪熱氣”。其種類有胡蘿卜、白蘿卜、水蘿卜、櫻桃蘿卜等，紫色胡蘿卜和橙色胡蘿卜是胡蘿卜中的兩個種類，由于其豐富的營養(yǎng)價值，在北歐等地被廣泛種植[1]。紫色胡蘿卜富含花青素、β-胡蘿卜素、多酚、維生素等物質(zhì)，此外還含有豐富的鉀、鎂、鈣等礦物質(zhì)元素。紫色胡蘿卜中所含的花青素主要是酰化花青素，其含量占花青素的70%以上，?；ㄇ嗨鼐哂休^高的穩(wěn)定性和更好的生物活性[2]?；ㄇ嗨鼐哂锌拱⒖寡?、抗氧化及減少動脈粥樣硬化等作用[3-5]。人體新陳代謝過程中產(chǎn)生超氧自由基、羥自由基等自由基，這些自由基是很多生理和病理疾病的積極參與者[6]。國內(nèi)外研究表明，部分植物果實、蔬菜及其提取物具有較強的清除自由基、延緩機體衰老的作用[7-9]。

我國大部分地區(qū)種植白蘿卜、橙色胡蘿卜和紫色胡蘿卜，其中紫色胡蘿卜在我國滇東北地區(qū)廣泛種植。國內(nèi)對橙色胡蘿卜和白蘿卜研究較多，白蘿卜具有較好的清除亞硝酸鹽的作用[10]，胡蘿卜中的多糖具有抗氧化活性[11]，蘿卜籽提取物還有較好的抑菌效果[12]，而紫色胡蘿卜其極高的營養(yǎng)價值一直沒有被大眾所認識。國外大量種植紫色胡蘿卜，將其作為一種良好的保健食品[2，4]，尤其是紫色胡蘿卜汁深受大眾喜愛。本實驗研究了紫色蘿卜汁的體外抗氧化作用，為紫色胡蘿卜的進一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色胡蘿卜、橙色胡蘿卜、白蘿卜：購買自云南省昭通市。

硫酸亞鐵、鄰菲啰啉、過氧化氫30%、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、焦性沒食子酸、三（羥甲基）氨基甲烷、鄰苯三酚、無水乙醇、硫酸、鹽酸、福林酚、無水碳酸鈉、氯化鉀、醋酸鈉、冰乙酸等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

UV759s型紫外-可見分光光度計：上海精科實業(yè)有限公司；CP214型號電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；TG16-WS高速臺式離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；H.H.S11-4R型電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械五厰；HR2826型飛利浦榨汁機：珠海經(jīng)濟特區(qū)飛利浦家庭電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘿卜汁的制備

紫色胡蘿卜洗凈去芯，壓榨取汁，汁液在離心機中4 000 r/min離心15 min，取上清液，備用。

白蘿卜和橙色胡蘿卜直接洗凈榨汁，4 000 r/min離心處理15 min，取上清液，備用。

1.3.2 紫色胡蘿卜總酚含量測定

采用Folin-酚法，按文獻[13]測定總酚含量。配制質(zhì)量濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的沒食子酸工作液，分別精密吸取上述沒食子酸工作液1 mL，加入10 mL 的具塞試管內(nèi)，加入10%Folin-酚試劑5 mL，5～8 min后加入4 mL 7.5%的Na2CO3溶液，蒸餾水定容至25 mL，充分搖勻，避光靜置反應(yīng)2 h，在波長765 nm處測定吸光度值，以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標（x），以吸光度值為縱坐標（y），制作標準曲線，得回歸方程：y=0.011 4x+0.018 9（r=0.999 1），該標準曲線線性范圍為吸光度值0～0.915 3。

25 mL具塞試管中加入稀釋的紫色胡蘿卜汁1 mL，加入10%Folin-酚試劑5 mL，按上述方法測定紫色胡蘿卜汁溶液的吸光度值，通過沒食子酸標準曲線計算樣品的總酚含量。

1.3.3 紫色胡蘿卜總花青素含量的測定

采用pH示差法，按文獻[14]測定紫色胡蘿卜中花色苷的含量。取0.025 mol/L、pH 1.0的HCl-KCl緩沖溶液和0.4 mol/L、pH 4.5 HAc-NaAc緩沖溶液各4.5 mL，分別加入待測樣品0.5 mL，在暗處放置30 min，分別測定兩樣品在波長510 nm和700 nm處的吸光度值。按下式計算稀釋液吸光度值A(chǔ)。

式中：（A510nm-A700nm）pH1.0為樣品在pH 1.0的緩沖液中在波長510 nm和700 nm處的吸光度值之差；（A510nm-A700nm）pH4.5為樣品在pH 4.5的緩沖液中在波長510 nm和700 nm處的吸光度值之差。待測樣品中花色苷的含量為：

式中：C為待測樣品中花色苷的含量，mg/L；MW為樣品中主要花色苷矢車菊-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量，為449.2；DF為稀釋因子；ε為樣品中主要花色苷的的摩爾吸收率，為26 900；l為比色杯厚度，cm。

1.3.4 不同稀釋倍數(shù)的蘿卜汁對·OH的清除作用

羥自由基清除率的測定方法參考文獻[15]進行，以不同質(zhì)量濃度的維生素C為陽性對照，分別在10 mL具塞試管中加不同濃度的蘿卜汁0.1 mL，依次加入0.75 mmol/L FeSO41 mL，0.75 mmol/L鄰二氮菲1 mL，最后加入0.01%H2O21 mL，37 ℃保溫1 h，以4 mL蒸餾水調(diào)零?？瞻坠苡?.1 mL蒸餾水代替蘿卜汁，1 mL蒸餾水代替0.01%H2O2，損傷管用0.1 mL蒸餾水代替蘿卜汁，樣品空白用1 mL蒸餾水代替0.01%H2O2?！H清除率計算公式如下：

式中：A0為空白管的吸光度值；A1為損傷管的吸光度值；A2為樣品空白管的吸光度值；A3為樣品對照管的吸光度值。

1.3.5 不同稀釋倍數(shù)的蘿卜汁對H2O2的清除作用

測定方法參考文獻[15]，以不同濃度的維生素C為陽性對照，分別在25 mL具塞試管中加不同質(zhì)量濃度的蘿卜汁0.5 mL，加入40 mmol/L H2O22.5 mL，加入7 mL蒸餾水，室溫反應(yīng)10 min后在波長230 nm處測定吸光度值?？瞻捉M用0.5 mL蒸餾水代替紫色胡蘿卜汁，樣品空白用2.5 mL蒸餾水代替H2O2。H2O2清除率計算公式如下：

式中：A0為不加蘿卜汁的吸光度值；A1為樣品對照組的吸光度值，即加蘿卜汁又加40mmol/LH2O2；A2為不加40mmol/L H2O2的吸光度值。

1.3.6 不同稀釋倍數(shù)的蘿卜汁對O2-·的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化法產(chǎn)生O2-·，以不同質(zhì)量濃度的維生素C為陽性對照，添加不同稀釋倍數(shù)的蘿卜汁進行清除，測定方法參考文獻[16]，并略做修改。10 mL具塞試管中加入1.5 mL 0.05 mol/L pH 8.2 的Tris-HCl緩沖溶液，1.5 mL蒸餾水，搖勻，25 ℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入25 ℃預(yù)熱3 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL，空白管用10 mmol/L的HCl代替鄰苯三酚，迅速搖勻后倒入比色杯中，在波長325 nm處測定吸光度值，計算線性范圍內(nèi)每1 min吸光度值的增加值，即為鄰苯三酚的自氧化速率ΔA對照。測定待測樣品時加入鄰苯三酚前先加入1.5 mL不同稀釋倍數(shù)的蘿卜汁，同時減少同體積的蒸餾水，其余操作同上，測出ΔA樣品。超氧陰離子的清除率計算公式如下：

按上式計算出超氧陰離子的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫色胡蘿卜汁總酚和花青素含量的測定結(jié)果

2.1.1 紫色胡蘿卜汁總酚含量的測定

根據(jù)1.3.2的方法，測定吸光度值，利用沒食子酸標準曲線計算紫色胡蘿卜總酚含量，結(jié)果見表1。紫色胡蘿卜汁中，總酚含量為23.90 mg/mL。

表1 紫色胡蘿卜汁總酚含量測定Table 1 Determination of total phenolic contents of purple carrot juice

2.1.2 紫色胡蘿卜汁花青素含量的測定

根據(jù)1.3.3的方法，測定了不同稀釋倍數(shù)紫色胡蘿卜汁中花青素的含量，結(jié)果見表2。紫色胡蘿卜中花青素的含量為287.62 mg/L。

表2 紫色胡蘿卜汁花青素含量測定Table 2 Determination of anthocyanin content of purple carrot juice

2.2 不同稀釋倍數(shù)的蘿卜汁對·OH的清除率

不同稀釋倍數(shù)的蘿卜汁對·OH的清除率見圖1。由圖1（A）可知，蘿卜汁稀釋后，還原能力逐漸降低。加入相同體積和相同稀釋倍數(shù)的蘿卜汁時，紫色胡蘿卜汁表現(xiàn)出了較強的抗氧化活性，橙色胡蘿卜汁次之，白蘿卜汁最低。紫色胡蘿卜原汁對·OH的清除率為97.75%，橙色胡蘿卜原汁78.67%，白蘿卜原汁僅為35.10%。稀釋倍數(shù)為5倍時，紫色胡蘿卜汁清除率可達50%以上，橙色蘿卜汁和白蘿卜汁均低于20%。

圖1（B）為不同質(zhì)量濃度的維生素C對羥自由基的清除率，在1 000～4 200 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性回歸方程為：y=16.059x+0.132 5（R2=0.999 5）。從圖1可看出，稀釋5倍的紫色胡蘿卜汁對·OH的清除率為50%，相當于質(zhì)量濃度為3 100 mg/L的維生素C對·OH的清除率，IC50為3 100 mg/L?？梢?，紫色胡蘿卜汁對·OH具有較強的清除能力。

圖1 0.1 mL不同稀釋倍數(shù)蘿卜汁(A)和不同質(zhì)量濃度維生素C(B)對·OH的清除率Fig.1 The scavenging activity of 0.1 ml different dilution radish juice(A) and different concentrations of vitamin C (B) on·OH

2.3 不同稀釋倍數(shù)的蘿卜汁對H2O2的清除率

圖2 0.5 mL不同稀釋倍數(shù)蘿卜汁(A)和不同質(zhì)量濃度維生素C(B)對H2O2的清除率Fig.2 The scavenging activity of 0.5 ml different dilution radish juice(A) and different concentrations of vitamin C (B) on H2O2

不同稀釋倍數(shù)的蘿卜汁對H2O2清除率見圖2。由圖2（A）可知，稀釋倍數(shù)越大，其對H2O2的清除率越低，隨著蘿卜汁濃度的增加，其對H2O2的清除率也逐漸增加。紫色胡蘿卜汁對H2O2的清除率比橙色和白色蘿卜汁的清除率都高，當稀釋倍數(shù)為50倍時，紫色胡蘿卜汁的清除率27.3%，橙色胡蘿卜汁的清除率11.06%，白色胡蘿卜汁清除率僅為8.06%，當稀釋倍數(shù)為8倍時，紫色胡蘿卜汁的清除率達92.7%，遠高于橙色胡蘿卜汁和白蘿卜汁的清除率。

圖2（B）為0.5 mL不同質(zhì)量濃度的維生素C對H2O2的清除率，在400～900 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)其線性回歸方程為：y=116.32x-27.225（R2=0.995 5），IC50為664 mg/L，當質(zhì)量濃度為900 mg/L時，其清除率為75.1%。實驗結(jié)果表明，稀釋15倍的紫色胡蘿卜汁對H2O2的清除率為56%，相當于700 mg/L的維生素C的清除率。

2.4 不同稀釋倍數(shù)的紫色胡蘿卜汁對超氧陰離子清除率

不同稀釋倍數(shù)的紫色胡蘿卜汁對超氧陰離子清除率見圖3。由圖3（A）可知，當加入紫色胡蘿卜汁的量為1.5 mL時，稀釋12倍的紫色胡蘿卜汁對超氧陰離子清除率是96.3%。在稀釋倍數(shù)為12～30的范圍內(nèi)，紫色胡蘿卜汁隨著稀釋倍數(shù)的增加，其對O2-·的清除率逐漸減弱。橙色胡蘿卜汁及白蘿卜汁對超氧陰離子的清除率幾乎為0。

圖3 1.5mL不同稀釋倍數(shù)紫色胡蘿卜汁(A)和不同質(zhì)量濃度維生素C(B)對O2-·的清除率Fig.3 The scavenging activity of 1.5 ml different dilution radish juice(A) and different concentrations of vitamin C (B) on O2-·

圖3（B）為不同質(zhì)量濃度的維生素C對O2-·的清除率曲線，在20～80 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性回歸方程為：y=1 770.0x-12.932（R2=0.999 6），IC50為35.6 mg/L。稀釋20倍的紫色胡蘿卜汁對O2-·的清除率相當于40 mg/L的維生素C對O2-·的清除率。

3 結(jié)論

研究了紫色胡蘿卜汁體外對·OH、H2O2和O2-·的清除作用，并與橙色胡蘿卜汁和白蘿卜汁進行對比。結(jié)果表明，紫色、橙色胡蘿卜汁及白蘿卜汁都具有體外抗氧化活性，紫色胡蘿卜汁表現(xiàn)出了較高的抗氧化活性。此外，紫色胡蘿卜富含多糖等物質(zhì)，值得進一步的深入研究和開發(fā)利用。

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