超高效液相色譜法測定水果中咪鮮胺殘留量

賈巧莉，王明強*

（1.云南省曲靖市質量技術監(jiān)督綜合檢測中心，云南 曲靖 655000；2.云南省肉制品質量監(jiān)督檢驗中心，云南 曲靖 655000）

咪鮮胺（prochloraz）是一種廣譜殺菌劑，其作用機理是通過抑制甾醇的生物合成，從而使菌體細胞膜功能受破壞而起作用，咪鮮胺廣泛用于果樹、蔬菜、谷物病害防止及水果的儲藏保鮮和多類病害的防治，能廣泛治療多種瓜果蔬菜的炭疽病、葉斑病[1-3]等病害，對香蕉、蘋果和柑橘尤其有效。在國內外都會大量使用，咪鮮胺最大殘留限量一直被美國和歐盟嚴格監(jiān)測，在水果中的最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）一直在很低的水平上[4]。咪鮮胺屬低毒殺菌劑，其代謝產(chǎn)物具有環(huán)境毒理作用。因此，建立咪鮮胺在水果等樣品中的檢測方法很有必要。

目前，對于咪鮮胺殘留量測定的方法主要有氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[5-6]聯(lián)用、高效液相色譜-質譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[7-8]聯(lián)用，雖然前處理簡單，但儀器昂貴難以普及應用；采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9]和氣相色譜法（gas chromatography，GC）[10-11]，但前處理復雜且靈敏度相對超高效液相色譜法（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）[13-14]低。

本研究采用超高效液相色譜法測定水果中咪鮮胺的殘留量，克服了儀器昂貴難以普及應用和前處理復雜且靈敏度低的缺點，該方法具有前處理簡便、靈敏度高、方法可靠的特點，并有效提高檢測效率，從而建立一套快速、便捷及成本低的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香蕉、蘋果和柑橘：均采自于曲靖市西苑小區(qū)農(nóng)貿(mào)市場。

咪鮮胺標準品：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研研制所（中國天津）；甲醇、乙腈和丙酮（均為色譜純）：美國Fisher Scientific公司；氯化鈉、氨水和甲酸（均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；超純水：實驗室自制。

1.2 儀器與設備

UltiMate3000超高效液相色譜儀、VWD-3400紫外檢測器、TTC-3000柱溫箱、WPS-3000自動進樣器、安CHROMLETEON 6變色龍色譜工作站：美國戴安公司；Milli-Q Advantage A10超級純水機：美國Millipore公司；CT15RT多用途高速冷凍離心機：美國Thermo公司；Vortex-3漩渦混勻器：德國IKA公司；PHS-3C 酸度計：上海精密科學儀器有限公司；AE200分析天平：瑞士梅特勒公司；T-50微孔溶劑過濾器、微孔過濾膜（直徑50 mm，孔徑0.45 μm）：天津津騰過濾器件廠；Bond Elut Plexa PCX固相萃取柱：美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

將樣品勻漿后準確稱取10.0 g于50 mL離心管中，加入10.0 mL乙腈，渦旋混勻50 s，加入2.0 g氯化鈉，振蕩混勻8 min，4 000 r/min離心6 min，靜置2 min分層、澄清。準確吸取上清液5.0 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，加入2.0 mL超純水和0.2 mL甲酸，混勻，準備凈化。將待凈化液轉移至經(jīng)過3.0 mL乙腈和3.0 mL水活化后的PCX固相萃取柱中。依次用2.0 mL丙酮、2.0 mL乙腈-氨水溶液（分別取30.0 mL乙腈和5.0 mL氨水于100 mL容量瓶中，加水）洗滌，抽至近干后用3.0 mL乙腈-氨水溶液洗脫并收集洗脫液。洗脫液于50 ℃條件下氮氣吹干，殘留物用甲醇溶解定容，混合均勻后過濾膜，供UPLC測定。

1.3.2 咪鮮胺標準溶液的配制

咪鮮胺標準溶液的配制：將1 mL咪鮮胺標準品（100 μg/mL，1 mL/支）全部移入10 mL容量瓶，用甲醇稀釋定容至刻度配制成質量濃度為10 μg/mL的咪鮮胺標準儲備液，再用甲醇逐步稀釋，配制成質量濃度分別為0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、3.0 μg/mL、5.0 μg/mL的標準工作溶液系列。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Thermo C18色譜柱（2.2 μm，2.1 mm×50 mm）；流動相為甲醇∶水=70∶30（V/V）（經(jīng)超聲脫氣和膜過濾）；檢測波長225 nm。流速1.0 mL/min。柱溫30℃。進樣量10 μL。

1.3.4 咪鮮胺殘留量計算公式

咪鮮胺殘留量計算公式如下：

式中：X為樣品中咪鮮胺殘留量，mg/kg；C為所測試樣樣品質量濃度，μg/mL；V為樣品定容體積，mL；m為樣品質量（果樣以鮮質量計），g。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

本研究分別考慮了甲醇-水、乙腈-水、乙酸-甲醇流動相對色譜分離效果和咪鮮胺保留時間的影響，結果表明甲醇-水分離效果最好并且保留時間短，為了進一步得到較好的峰形，又達到快捷簡便的要求，經(jīng)過多次甲醇-水體積配比試驗，確定甲醇-水體積比為70∶30，流速為1.0 mL/min時，峰面積值最大且樣品分離效果好，咪鮮胺的峰形也好，所以選用甲醇-水（70∶30，V/V）作為流動相，咪鮮胺的保留時間為5.550 min。

2.2 檢測波長的選擇

將標準溶液在波長180～400 nm之間進行紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)在波長210 nm、225 nm、230 nm處有強吸收。選用波長210 nm測定靈敏度高，但基線干擾大，而試樣在波長225 nm處吸收較在波長230 nm處稍強，綜合考慮到咪鮮胺本身的性質以及溶劑、基質干擾、靈敏度等因素，最后確定最佳檢測波長為225 nm。

2.3 標準品及樣品的超高效液相色譜檢測

標液及樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，按照色譜工作條件的要求進行測定咪鮮胺標準品與樣品，所得到的色譜圖見圖1。

從上世紀80年代延續(xù)至今的3個品種中，青啤到目前已經(jīng)推出IPA、經(jīng)典1903、全麥白啤、黑啤、原漿、皮爾森等20多個口味、1500多個品種規(guī)格的產(chǎn)品矩陣。僅2017年，青島啤酒就研發(fā)創(chuàng)新了40多個新品種，產(chǎn)品總數(shù)達1500多個品種、規(guī)格。2016年反響熱烈的“魔獸罐”還沒走遠，2017年一大波新品就再度投向市場——青島啤酒戰(zhàn)狼罐、深夜食堂限量版、極地歡聚罐、鴻運必勝裝，2018年世界杯主題產(chǎn)品“繽紛加油罐”等接連上市。

圖1 咪鮮胺標準品(A)及樣品(B) UPLC色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of prochloraz standard(A)and sample(B)

由圖1可知，在波長225 nm，甲醇-水體積比為70∶30，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL時，咪鮮胺具有典型的峰型，咪鮮胺標準品的保留時間為5.547 min；樣品中咪鮮胺在此條件下分離效果好且峰面積值最大，保留時間為5.553 min。

2.4 靈敏度和線性范圍

取系列質量濃度為1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.0 μg/mL、5.0 μg/mL的咪鮮胺標準工作溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，按上述色譜條件進樣10 μL，以咪鮮胺標準進樣質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，結果見圖2。

圖2 咪鮮胺標準曲線Fig.2 Standard curve of prochloraz

由圖2可知，標準曲線線性回歸方程：Y=0.107 6X+0.021 2，相關系數(shù)R=0.999 7，以3倍信噪比時的進樣量計算最低檢出限（limit of detection，LOD）0.032 mg/kg，結果表明咪鮮胺在0～5.0 μg/mL的質量濃度范圍內峰面積與咪鮮胺的質量濃度線性關系良好。

2.5 加標回收率實驗

表1 加標回收率實驗結果Table 1 Results of adding standard recovery rate tests

選取香蕉、蘋果和柑橘3種經(jīng)常使用咪鮮胺的水果，分別準確稱取10.0 g進行0.2 mg/kg、0.4 mg/kg、1.0 mg/kg 3個質量濃度添加水平進行加標回收率試驗，每個水平設3個平行樣。結果如表1所示。由表1可知，3種水果樣品添加不同質量濃度咪鮮胺標品，回收率范圍在93.00%～101.10%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.3%～3.2%，均＜5%，其結果表明該方法的準確度較高，可滿足水果中咪鮮胺殘留量測定的要求[15]。

2.6 精密度實驗

按試驗條件取10.0 μg/mL的咪鮮胺標準品重復進樣10次，檢測咪鮮胺含量量分別為10.287 μg/mL、10.175 μg/mL、10.168 μg/mL、10.236 μg/mL、10.363 μg/mL、10.275 μg/mL、10.236 μg/mL、9.920 μg/mL、9.957 μg/mL、9.981 μg/mL，平均值為10.159 μg/mL，測定結果RSD為0.219%＜5%，其結果表明該方法的精密度良好，可滿足定量分析的要求[15]。

2.7 水果樣品中咪鮮胺殘留量的檢測

表2 市售水果樣品中咪鮮胺的殘留量檢測結果Table 2 Determination results of prochloraz residual amount in market fruit samples

3 結論

本研究建立了超高效液相色譜法對3種水果樣品中咪鮮胺殘留量的檢測，以甲醇∶水=70∶30（V/V）為流動相，流速1.0 mL/min條件下等度洗脫，檢測波長225 nm，快速測定水果中咪鮮胺殘留量。結果表明，咪鮮胺標準線性回歸方程為Y=0.107 6X+0.021 2，相關系數(shù)R=0.999 7，檢出限為0.032 mg/kg，加標回收率為93.00%～101.10%，精密度實驗結果相對標準偏差為0.219%，說明該方法準確度、重復性、精密度良好、操作簡便，可用于水果中咪鮮胺殘留量測定，是一種較為理想的分析方法。

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