超聲波輔助乙醇法浸提無(wú)核紫葡萄花青素工藝研究

楊 慧，賈文婷，吳 宏，吳洪斌，金新文*

（新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 石河子 832000）

葡萄是一種世界性的水果，富含糖、氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，被譽(yù)為“世界水果的明珠”[1-2]。無(wú)核紫葡萄（Vitis romanetiiRom.Caill.）別名無(wú)核黑、馬紐卡（Monukka），屬中晚熟品種，抗寒性、抗病性良好。果穗圓錐形，果皮呈紫紅色，皮薄肉脆、肉質(zhì)細(xì)膩、酸甜可口，可溶性固形物含量18%～21%，屬鮮食、制干、制汁多用的優(yōu)新品種，該品種現(xiàn)已在新疆大面積推廣[3-4]。目前新疆無(wú)核紫葡萄主要用于鮮食和制干[3-5]。

花青素（anthocyanidin）又稱花色素，屬黃酮類化合物，是一類廣泛分布在自然界中的多酚化合物，在植物的根、葉、莖和果實(shí)中廣泛存在。在自然狀態(tài)下，花青素在植物體內(nèi)常與各種單糖結(jié)合形成糖苷，稱為花色苷。1853年，由Marguart用來(lái)命名矢車菊花朵中的藍(lán)色提取物，現(xiàn)在作為同類物質(zhì)的總稱[6]。花青素具有防止腦神經(jīng)老化、清除體內(nèi)自由基、保護(hù)視力等多種生理活性功能[7]。目前對(duì)花青素的提取方法主要有溶劑提取法、超聲提取法、超臨界二氧化碳提取法[8-10]。超聲提取法具有明顯的優(yōu)勢(shì)，其強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、局部高溫和高加速度能使細(xì)胞壁的通透性提高，加速花青素進(jìn)入溶劑，提高提取率[11-14]。本試驗(yàn)用超聲波技術(shù)輔助乙醇法浸提無(wú)核紫葡萄中的花青素，以獲得較高純度的花青素，以期使新疆無(wú)核紫葡萄資源得到更充分利用，為新疆無(wú)核紫葡萄深加工和綜合利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮無(wú)核紫葡萄：購(gòu)自于石河子市果蔬批發(fā)市場(chǎng)。

HCl、KCl、CH3COONa和無(wú)水乙醇（均為分析純）：上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

pH 1.0 HCl-KCl緩沖液、pH 4.5 HCl-CH3COONa緩沖液、5%HCl-CH3CH2OH溶液：實(shí)驗(yàn)室配制[15]。

1.2 儀器與設(shè)備

DFY-500型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司；Neofuge 13臺(tái)式高速離心機(jī)：力康發(fā)展有限公司；BSA-CW型萬(wàn)分之一天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UV 2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津有限公司；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)海爾道夫公司；KQ-100DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無(wú)核紫葡萄中花青素提取工藝及操作要點(diǎn)

無(wú)核紫葡萄→預(yù)處理→粉碎→超聲波浸提→離心→上清液→定容→花青素測(cè)定

操作要點(diǎn)：將購(gòu)買的新鮮無(wú)核紫葡萄去柄，用蒸餾水洗凈，瀝干待用。稱取預(yù)處理過(guò)的無(wú)核紫葡萄100 g，用高速粉碎機(jī)粉碎，精確稱取1.000 0 g無(wú)核紫葡萄勻漿于100 mL三角瓶中，按照不同的料液比、提取溫度、提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)計(jì)試驗(yàn)在180 W超聲功率條件下進(jìn)行超聲波提取，在4 000 r/min條件下旋轉(zhuǎn)離心，得到澄清的色素上清液。取2 mL上清液，用5%HCl-CH3CH2OH稀釋定容至100 mL，分別移取10 mL，用pH 1.0 HCl-KCl緩沖液和pH 4.5 HCl-CH3COONa緩沖液稀釋至100 mL，靜置一段時(shí)間，測(cè)定花青素含量。

1.3.2 無(wú)核紫葡萄花青素的光譜分析

將無(wú)核紫葡萄花青素提取液在波長(zhǎng)450～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描分析，得出無(wú)核紫葡萄花青素的吸收光譜圖，以確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.3 無(wú)核紫花青素含量及其得率測(cè)定

用pH示差法原理對(duì)無(wú)核紫葡萄中花青素進(jìn)行定量分析。pH示差法原理是花青素發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換是pH的函數(shù)，而起干擾作用的褐色降解物的特性不隨pH變化。結(jié)合朗伯-比爾定律，在花青素最大吸收波長(zhǎng)下pH 1.0和pH 4.5的花青素溶液的吸光度值差值與花青素的含量成比例。根據(jù)FULEKI T的經(jīng)驗(yàn)公式[16]可計(jì)算出無(wú)核紫葡萄中的花青素含量。試驗(yàn)以蒸餾水作空白，計(jì)算公式如下：

式（1）中：C為無(wú)核紫葡萄提取液花青素含量，g/L；A表示吸光度值，由式（2）換算得來(lái)；ε為摩爾消光系數(shù)，26 900；L為比色皿光程，1 cm；MW為花青素分子質(zhì)量，449.2；DF為稀釋倍數(shù)50。

式（2）中：A700用來(lái)抵消無(wú)核紫葡萄樣液渾濁的影響。

式（3）中：V為無(wú)核紫葡萄提取液體積，mL；M為無(wú)核紫葡萄質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定：分別選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%，在料液比1∶20（g∶mL），提取溫度50 ℃條件下提取50 min，測(cè)定無(wú)核紫葡萄花青素含量及其得率。

料液比的確定：料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL），在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、提取溫度50 ℃條件下提取50 min，測(cè)定無(wú)核紫葡萄花青素含量及其得率。

提取溫度的確定：提取溫度分別為30 ℃、40 ℃、50℃、60 ℃、70 ℃，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比1∶20（g∶mL）條件下提取50 min，測(cè)定無(wú)核紫葡萄花青素含量及其得率。

提取時(shí)間的確定：分別設(shè)定提取時(shí)間為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比1∶20（g∶mL），提取溫度50 ℃條件下提取，測(cè)定無(wú)核紫葡萄花青素含量及其得率。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)對(duì)無(wú)核紫葡萄提取率影響顯著的因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以花青素得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終確定新疆無(wú)核紫葡萄花青素提取的最佳工藝條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 花青素提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for anthocyanin extraction conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)核紫葡萄在可見(jiàn)光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)的確定

將無(wú)核紫葡萄提取液在波長(zhǎng)450～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，無(wú)核紫葡萄花青素的最大吸收波長(zhǎng)為510 nm。

圖1 無(wú)核紫葡萄花青素吸收光譜Fig.1 Absorption spectrogram of anthocyanin Monukka grapes

2.2 各因素對(duì)提取效果的影響

2.2.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下的花青素得率如圖2所示。

由圖2可知，不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素提取效果有顯著影響，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)得率最高。但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)升高，花青素的得率逐漸降低，原因可能是花青素具有兩性特征，即其結(jié)構(gòu)中含有顯酸性的酚羥基和顯堿性的四價(jià)氧原子，致使花青素穩(wěn)定性受pH值變化影響較大，pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)直接影響色素的提取效果，因此選擇乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on anthocyanln yield

2.2.2 料液比對(duì)花青素提取效果的影響

不同料液比條件下的花青素得率如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)花青素得率的影響Fig.3 Effect of solid liquid ratio on anthocyanln yield

由圖3可以看出，當(dāng)料液比＜1∶20（g∶mL）時(shí)，花青素得率隨料液比的增加而增加，料液比＞1∶20（g∶mL）時(shí)，得率極速下降后趨于平穩(wěn)。說(shuō)明料液比過(guò)大，溶劑中含有大量的乙醇，與固體物料接觸機(jī)率增大，極性減小，不利于花青素的提取。因此選取1∶20（g∶mL）為最佳料液比。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)花青素提取效果的影響

不同提取溫度條件下的花青素得率如圖4所示。

圖4 溫度對(duì)花青素得率的影響Fig.4 Effect of temperature on anthocyanln yield

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，花青素得率逐漸增大，溫度達(dá)到60 ℃時(shí)花青素得率最大，當(dāng)溫度＞60 ℃后，花青素得率迅速降低，原因可能是溫度過(guò)高使花青素穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致花青素降解。故選取最佳提取溫度為60 ℃。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)花青素提取效果的影響

不同提取時(shí)間的花青素得率如圖5所示。

圖5 提取時(shí)間對(duì)花青素得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on anthocyanln yield

由圖5可知，提取時(shí)間40 min時(shí)花青素得率最高，為2.85%，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，花青素得率開(kāi)始降低，原因可能是超聲波具有較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間作用會(huì)破壞花青素的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致花青素降解。因此提取時(shí)間為40 min最為合適。

2.3 提取無(wú)核紫葡萄花青素的最佳工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 花青素提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments foranthocyanin extraction conditions optimization

從表2極差分析結(jié)果可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)的極差最大，其次是提取溫度、料液比、提取時(shí)間，可見(jiàn)影響無(wú)核紫葡萄花青素得率的因素主次順序?yàn)锳＞C＞B＞D，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間。無(wú)核紫葡萄花青素超聲提取的最佳工藝組合為A3B1C1D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%、料液比為1∶15（g∶mL）、提取溫度為50 ℃、提取時(shí)間為40 min。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果無(wú)核紫葡萄花青素平均得率為3.35%，高于正交試驗(yàn)表中最大得率3.19%，故可認(rèn)為該組合為超聲波輔助法提取無(wú)核紫葡萄花青素的最佳提取工藝。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis results of orthogonal experiments

由表3方差分析可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和料液比均為顯著因素，而提取時(shí)間在試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平下為不顯著因素。原因可能是超聲波強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和機(jī)械剪切作用，提取30～50 min已經(jīng)超過(guò)了限度，提取效果已達(dá)最大化，因此可以推論無(wú)核紫葡萄花青素提取時(shí)間應(yīng)該控制在40 min以內(nèi)。

2.4 對(duì)比試驗(yàn)

為了考察超聲波輔助乙醇法提取無(wú)核紫葡萄花青素的得率，該文將其與傳統(tǒng)乙醇浸提法進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。

表4 無(wú)核紫葡萄花青素兩種提取方法的比較Table 4 Comparison of two extraction methods of anthocyanin from Monukka grape

從表4可以看出，與傳統(tǒng)乙醇法相比，超聲波輔助乙醇法浸提無(wú)核紫葡萄花青素得率提高了20.5%，說(shuō)明超聲波技術(shù)能有效促進(jìn)無(wú)核紫葡萄花青素的提取。

3 結(jié)論

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，新疆無(wú)核紫葡萄花青素超聲提取過(guò)程中受乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素影響較大，且各因素水平數(shù)據(jù)之間存在一定的梯度差。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)核紫葡萄中花青素最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、料液比1∶15（g∶mL）、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間40 min。此條件下花青素平均得率為3.35%。對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波輔助乙醇法較傳統(tǒng)乙醇法浸提效果好，花青素得率提高了20.5%。

利用超聲波技術(shù)輔助乙醇法提取無(wú)核紫葡萄花青素具有節(jié)約時(shí)間、能耗低、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，可為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)無(wú)核紫葡萄花青素的提供理論基礎(chǔ)。

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