高山被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸發(fā)酵條件優(yōu)化

李 霞，王道會，徐建春

（青島瑯琊臺集團股份有限公司，山東 青島 266400）

花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）屬于n-6系列多不飽和脂肪酸，是前列腺素、環(huán)前列腺素和白三烯類等二十碳衍生物的直接前體[1]。ARA具有多種生理功能，可降低血脂，緩解胰島素抵抗，促進神經系統(tǒng)發(fā)育和視網膜發(fā)育，尤其對于胎兒和嬰幼兒腦部發(fā)育具有重要作用[2]。ARA目前被廣泛應用于保健品、藥品及嬰幼兒食品領域，其傳統(tǒng)生產工藝主要是從動物肝臟、豬腎上腺、蛋黃和深海魚油中直接提取[3]，產量低且受季節(jié)影響，無法滿足市場需求。而微生物發(fā)酵法生產ARA具有生產周期短，不受原料、產地和季節(jié)限制等明顯的優(yōu)勢，目前已成為ARA的主流生產模式[4]。高山被孢霉（Mortierella alpina）被認為是最佳的ARA 生產菌株。該菌株具有ARA 含量高且脂肪酸組成合理等特點，是目前ARA生產方面的研究熱點[1]。

影響高山被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸的因素很多，林煒鐵等[5]曾報道不同的接種方式和接種量會對被孢霉（Mortierellasp.）的菌絲形態(tài)產生影響，采用孢子接種且孢子濃度為4.0×105個/mL時，菌體形態(tài)為分散絲狀，可得到最大生物量和出油率。而PARK E Y等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)，過大的攪拌速率和通氣量會產生較大的剪切力，剪切下的被孢霉菌絲消耗碳源進行自身修復，使ARA的合成受到影響；較低直徑的小球狀菌體更利于ARA的合成。碳源和氮源是影響微生物生長的最關鍵營養(yǎng)元素。當微生物處于營養(yǎng)充足和條件適宜的環(huán)境中，細胞內各種代謝較為活躍且處于平衡狀態(tài)，在此階段菌體代謝以促進細胞生長為主，而細胞中脂質含量則維持在較低水平；當環(huán)境條件改變時，菌體內代謝平衡被打破，有利于某些代謝產物的積累[8]。當培養(yǎng)基中氮源及磷、鋅、鎂等微量元素缺乏，但碳源充足時，微生物將停止生長進入脂積累代謝狀態(tài)[9]。周蓬蓬等[10]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度在25 ℃時，高山被孢霉菌絲生長快速，而20 ℃培養(yǎng)可獲得最大出油率和ARA含量，最佳培養(yǎng)方式為分段控溫方法；而秦新政等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)溫度為31 ℃時可獲得最大菌絲生長速率。培養(yǎng)基pH值是影響微生物生長的另一重要環(huán)境因素，目前報道的高山被孢霉的最佳培養(yǎng)基pH值主要集中在6.0～7.0[12-13]，偏酸性環(huán)境適宜高山被孢霉的脂質積累[14]。

本研究利用誘變育種篩選一株高山被孢霉高產花生四烯酸菌種，針對該菌種進行了培養(yǎng)條件的優(yōu)化，并進行10 L自動發(fā)酵罐的放大驗證實驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

高山被孢霉（Mortierella alpina）菌株由青島瑯琊臺集團股份有限公司科海研究所自行馴化保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：土豆200 g/L，葡萄糖2%，瓊脂1%。

種子液體培養(yǎng)基：葡萄糖35 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨5 g/L，MgSO40.8 g/L，KH2PO41 g/L，（NH4）2HPO41.2 g/L，Na2SO40.4 g/L，pH 6.0～7.0，120 ℃條件下滅菌30 min。

發(fā)酵基本培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，酵母粉15 g/L，蛋白胨8 g/L，MgSO41 g/L，KH2PO41 g/L，（NH4）2HPO41.5 g/L，（NH4）2SO40.6 g/L，CaCl2·2H2O 0.5 g/L，pH 6.0～7.0，120 ℃條件下滅菌30 min。

1.1.3 化學試劑

MgSO4、KH2PO4、（NH4）2HPO4、（NH4）2SO4、CaCl2·2H2O、Na2SO4等無機鹽試劑均為分析純：天津巴斯夫化工有限公司。

1.2 儀器與設備

PL602-L型電子天平、FE20型pH計：上海梅特勒托利多公司；DZG-6090型電熱真空干燥箱：上海森信實驗儀器公司；RE52A型旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HYL-C型組合式搖床：太倉強樂實驗設備有限公司；HSY10L型全自動發(fā)酵罐：無錫匯森生物設備有限公司；Trace1300型氣相色譜儀：美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將保存菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板，于26 ℃條件下活化培養(yǎng)5～7 d。

1.3.2 種子培養(yǎng)

從活化培養(yǎng)基刮下孢子接種于種子培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/500 mL，26 ℃、搖床轉速180 r/min 條件下培養(yǎng)5 d，作為發(fā)酵種子液。

1.3.3 搖瓶培養(yǎng)

將種子液中菌體用分散機打散，以一定濃度將菌體片段接種于發(fā)酵基本培養(yǎng)基中，裝液量100 mL/500 mL，26 ℃、搖床轉速180 r/min條件下培養(yǎng)5～7 d。

1.3.4 菌體干質量的測定

將搖瓶培養(yǎng)得到的發(fā)酵液抽濾得到菌體，以蒸餾水沖洗3次，抽濾沖洗液；將得到的菌體置于45 ℃恒溫干燥箱中烘至質量恒定。菌體干質量計算公式如下：

1.3.5 菌體脂質提取

將干菌體粉碎后加入正己烷，采用索氏抽提法[15]進行脂質提取，所得提取液在40 ℃下減壓蒸餾，獲得菌體脂質。菌體出油率計算公式如下：

1.3.6 菌體脂質的脂肪酸組成分析及ARA含量分析

樣品前處理及菌體脂質脂肪酸組成采用高效氣相色譜法測定，具體操作參照國標GB 26401—2011《食品安全國家標準食品添加劑花生四烯酸油脂（發(fā)酵法）》中對于發(fā)酵生產ARA的定量檢測方法。ARA含量指ARA在菌體油脂的脂肪酸組成中所占比例，其計算公式如下：

1.3.7 單因素試驗及放大試驗設計

綜合前人研究成果和預試驗結果，本實驗選定溫度、時間、搖床轉速、碳氮比和pH值作為單因素實驗變量，以優(yōu)化高山被孢霉的培養(yǎng)條件。為驗證優(yōu)化后培養(yǎng)條件的生產應用效果，本實驗采用10 L全自動發(fā)酵罐，對優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進行放大實驗。

2 結果與分析

2.1 搖床轉速對菌體形態(tài)及發(fā)酵產物的影響

高山被孢霉屬于絲狀真菌，在進行液體培養(yǎng)時會呈現(xiàn)不同的菌體形態(tài)，主要有球狀和絲狀。球狀菌體是由菌絲緊密地纏繞組成單個獨立體，絲狀菌體則是菌絲均勻地懸浮在整個液體培養(yǎng)基中，不同的菌體形態(tài)會對出油率和ARA含量產生影響。本實驗發(fā)現(xiàn)，采用菌體片段接種時，接種量對菌體形態(tài)無顯著影響，均為小球狀；而影響菌體形態(tài)的主要因素為培養(yǎng)轉速。搖床轉速單因素試驗培養(yǎng)條件為24 ℃條件下培養(yǎng)7 d，pH值為6.0，碳氮比為2.5，搖床轉速梯度設計為80 r/min、120 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min，結果見表1。

表1 搖床轉速對菌體形態(tài)及發(fā)酵產物的影響Table 1 Effect of the rotate speed on mycelial morphology and fermentation results

由表1可知，當轉速較低處于80～120 r/min時，菌絲纏繞較為緊密，菌體形態(tài)為直徑較大的球狀，菌體干質量和出油率較低。隨著轉速的增長，球狀菌體直徑逐漸減??；當轉速達到200 r/min時，菌體形態(tài)變?yōu)榻z狀。實驗結果表明，當搖床轉速為180 r/min時，菌體為直徑1～2 mm小球狀，菌體干質量、出油率和ARA含量均達到最高，分別為45.5 g/L，24.8 g/L和50.6%；而菌體為絲狀時，菌體干質量和出油率均有所下降；得出培養(yǎng)最佳搖床轉速為180 r/min。

2.2 碳氮比對發(fā)酵產物的影響

本實驗碳氮比分別設計為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0共7個梯度，發(fā)酵周期7 d，溫度24 ℃，pH值為6.0，搖床轉速180 r/min，結果如圖1所示。

圖1 碳氮比對發(fā)酵產物的影響Fig.1 Effect of C/N ratio on fermentation results

由圖1可知，在發(fā)酵完成后，當碳氮比達到2.5時，可獲得最大菌體干質量為49.0 g/L；而之后隨著碳氮比的持續(xù)升高，菌體干質量開始下降，說明較低的含氮量開始降低菌體的生長速度。碳氮比達到3.0時可獲得最大出油率和ARA含量，分別為24.8 g/L和49.8%，此后隨著碳氮比的上升，總體出油率開始由于生物量的降低而下降，ARA含量則基本不變。因此，綜合出油率和ARA含量，培養(yǎng)基最佳碳氮比應控制在3.0。

2.3 溫度對發(fā)酵產物的影響

圖2 溫度對發(fā)酵產物的影響Fig.2 Effect of temperature on fermentation results

本實驗采用恒溫發(fā)酵，分別設定發(fā)酵溫度為18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃，發(fā)酵周期7 d，pH值為6.0，搖床轉速180 r/min，碳氮比為3.0，對發(fā)酵溫度進行進一步優(yōu)化，結果如圖2所示。

由圖2可知，培養(yǎng)溫度在28 ℃時，菌體生長迅速，可獲得最大生物量，菌體干質量為45.6 g/L。而溫度為26 ℃時可獲得最大出油率和ARA含量分別為23.6 g/L和48.8%，因此綜合考慮最佳發(fā)酵溫度為26 ℃。

2.4 pH值對發(fā)酵產物的影響

本實驗設定pH值分別為6.0、6.2、6.5、6.8、7.0，發(fā)酵溫度26 ℃，周期7 d，搖床轉速180 r/min，碳氮比為3.0，考察pH值對發(fā)酵產物的影響，結果如圖3所示。

圖3 pH值對發(fā)酵產物的影響Fig.3 Effect of pH on fermentation results

由圖3可知，pH值為6.5時，可獲得最大出油率達到22.6 g/L，ARA含量為45.1%；而生物量和ARA含量均在pH值為6.2時達到最高，分別為46.7 g/L和51.1%，出油率為21.7 g/L。以ARA產量為主要考量指標，綜合考慮培養(yǎng)基pH值為6.2較好。

2.5 發(fā)酵時間對發(fā)酵產物的影響

按照優(yōu)化后的發(fā)酵條件對高山被孢霉進行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)基碳氮比3.0，pH值為6.2，發(fā)酵溫度26 ℃，搖床轉速180 r/min，發(fā)酵時間分別為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d。發(fā)酵結束后測定菌體干質量、出油率及ARA含量，考察發(fā)酵時間對發(fā)酵產物的影響，結果見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對發(fā)酵產物的影響Fig.4 Effect of fermentation time on fermentation results

由圖4可知，菌體的快速生長期為第2～3天，同時伴隨著油脂的迅速積累；菌體干質量在第4天可達42.7 g/L，隨后增長緩慢，出油率在第5天達到最高為21.7 g/L，隨后基本穩(wěn)定；ARA含量也在第5 天達到最高為50.6%，隨后有所下降。因此，采用優(yōu)化后發(fā)酵條件培養(yǎng)5 d即可獲得最大ARA含量。

2.6 10 L發(fā)酵罐放大實驗

在搖瓶發(fā)酵的基礎上，采用10 L全自動發(fā)酵罐進行3次放大試驗，裝液量60%，接種量10%，消泡劑為聚氧丙烯甘油，發(fā)酵溫度26 ℃，罐壓0.05～0.08 MPa，通氣量4 000 L/h，發(fā)酵液pH值為6.2，發(fā)酵周期5 d，發(fā)酵結束后測定菌體干質量、出油率及ARA含量，實驗結果如表2所示。

表2 10 L發(fā)酵罐放大實驗Table 2 Amplification test for 10 L fermentation cylinder

由表2可知，在優(yōu)化后培養(yǎng)條件下，5 d發(fā)酵后平均菌體干質量為45.4 g/L，出油率為24.1 g/L，ARA含量為49.6%，菌體形狀為球狀，直徑1～2 mm。發(fā)酵產物及ARA產量與搖瓶培養(yǎng)相當，證明采用優(yōu)化工藝擴大培養(yǎng)的可行性。

3 結論

本實驗以發(fā)酵所得菌體干質量、出油率和ARA含量為主要參考指標，對高山被孢霉搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。通過對搖床轉速、培養(yǎng)基碳氮比、發(fā)酵溫度、pH值等參數進行單因素變量分析，確定本株高山被孢霉菌種的最佳培養(yǎng)條件為搖床轉速180 r/min，培養(yǎng)基碳氮比3.0，發(fā)酵溫度26 ℃，pH 值為6.2，發(fā)酵時間為5 d。在保持發(fā)酵參數不變的情況下，在10 L發(fā)酵罐進行放大實驗，裝液量60%，接種量10%，通氣量4 000 L/h，發(fā)酵周期縮短至5 d，所得菌體干質量、出油率和ARA含量分別為45.4 g/L、24.1 g/L和49.6%。證明了該發(fā)酵工藝的可行性，為進一步擴大培養(yǎng)提高生產效率打下基礎。

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