葛花枳椇子配伍對(duì)酒精性肝損傷大鼠血中乙醇濃度和肝中乙醇脫氫酶活性的量—時(shí)—效影響

劉明 陳紹紅 鐘贛生 柳海艷 趙桐

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是因長(zhǎng)期大量攝入酒精而造成的肝臟損傷疾病。隨著酒精攝入量的增加，該疾病呈漸進(jìn)性發(fā)展，可從最初的酒精性脂肪肝發(fā)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化［1］。隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，人們社交應(yīng)酬增多以及生存競(jìng)爭(zhēng)壓力增大，酗酒和酒精中毒呈日益增多趨勢(shì)。在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，酒精性肝病的發(fā)病形式主要以酒精性脂肪肝為主;在中國(guó)，酒精性疾病的發(fā)生率也與日俱增，主要以酒精性肝炎為主［2］。乙醇及其代謝產(chǎn)物和代謝過(guò)程中產(chǎn)生的代謝混亂是導(dǎo)致酒精性肝病的重要原因［3］。在古代文獻(xiàn)記載中，葛花枳椇子是最具有代表性的解酒藥對(duì)，葛花功用為解酒醒脾，枳椇子具有清熱利尿，解酒毒的功效，二者也較少用于其他疾病的治療。實(shí)驗(yàn)組前期通過(guò)借助現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)方法與手段，進(jìn)行了葛花和枳椇子不同比例配伍(1∶1、1∶2、和2∶1)，不同的提取方法(水提和醇提)對(duì)大鼠慢性酒精性肝損傷的防治研究，結(jié)果表明葛花枳椇子2∶1比例配伍采用傳統(tǒng)水提解酒保肝效果最佳［4］。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，通過(guò)研究酒后血中乙醇質(zhì)量濃度和肝中乙醇脫氫酶活性，探討不同劑量的葛花枳椇子2∶1比例配伍后解酒保肝是否存在量-時(shí)-效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取健康雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量180 ～200 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。許可證編號(hào)為SCXK(京)2012-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機(jī)分為6 組:空白組、模型組、東寶甘泰組、配伍低劑量組、配伍中劑量組、配伍高劑量組，其中空白組30 只，模型組、東寶甘泰組、配伍各劑量組每組各50 只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物 葛花為豆科植物野葛Pueraria lobata (Willd.)Ohwi 的花。枳椇子為鼠李科植物枳椇Hovenia dulcis Thunb 的干燥成熟種子。兩種藥材均購(gòu)自北京本草方源藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)方藥系李偉老師鑒定均為優(yōu)質(zhì)藥材。

葛花枳椇子混合煎液的制備:將葛花、枳椇子按2∶1的比例混合浸泡0.5 小時(shí)，第一次加10 倍量水煎煮提取1.5 小時(shí)，第二次加8 倍量水煎煮1 小時(shí)。濾過(guò)，合并濾液，濃縮至一定濃度。使用時(shí)，加去離子水配制成含生藥12 g/mL、6 g/mL、3 g/mL 濃度的藥液。

東寶肝泰藥液的制備:使用時(shí)用去離子水配成0.036 g/mL 濃度的藥液。

1.2.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 56°紅星二鍋頭酒:購(gòu)自北京紅星股份有限公司;東寶甘泰片:吉林通化東寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為:090503;生理鹽水:山東齊都藥業(yè)有限公司;組織乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)測(cè)定試劑盒:南京建成科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為:20130412;無(wú)水乙醇:北京化工廠生產(chǎn)，批號(hào)為:20130320;肝素鈉:優(yōu)級(jí)純。中國(guó)醫(yī)藥公司北京公司;鹽酸氨基脲:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為:20111215;甘氨酸:北京東勝泰博科技有限公司;焦磷酸鈉:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為:F20110503;氫氧化鈉:北京化工廠生產(chǎn)，批號(hào)為:20121120;高氯酸:北京化工廠生產(chǎn);乙醇脫氫酶:SIGMA 公司進(jìn)口;氧化型輔酶Ⅰ:SIGMA公司進(jìn)口

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):型號(hào)為TGL-16A，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司;恒溫水浴鍋:北京光明醫(yī)療儀器廠;快速混勻器:型號(hào)為SK-1，江蘇國(guó)華儀器廠;微量移液器:北京青云航空儀表有限公司;752-C 紫外光柵分光光度計(jì):上海第三分析儀器廠;電子分析天平:型號(hào)為AEL-160，日本產(chǎn)。

1.4 造模與給藥方法

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開(kāi)始造模，用56°紅星二鍋頭白酒灌胃，第1 周每天給酒8 mL/kg，1 次灌胃，連續(xù)2 周;第3 周每天給酒10 mL/kg，以后每周稱重，根據(jù)體重計(jì)算給酒量，連續(xù)12 周。除正常喂養(yǎng)外，空白組每天給予去離子水，灌胃體積為10 mL/kg，模型組給予56°紅星二鍋頭白酒灌胃，配伍各劑量組每日上午先給予相應(yīng)濃度的藥液，給藥體積為10 mL/kg，下午給予白酒灌胃。連續(xù)12 周，每周給大鼠稱重，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.5 對(duì)慢性酒精性肝損傷大鼠血中乙醇濃度的影響

1.5.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 (1)用生理鹽水將新鮮正常大鼠全血(經(jīng)抗凝處理)稀釋，配成含乙醇量分別為25 mg/dL、50 mg/dL、100 mg/dL、200 mg/dL、400 mg/dL、800 mg/dL 的溶液。(2)上述各管加入3.4%高氯酸4 mL，混勻，于3000 r/min 離心5分鐘，取上清液作為標(biāo)準(zhǔn)液。(3)取6 只試管，分別加入乙醇脫氫酶(ADH)-氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD +)液4.9 mL;其中一支加蒸餾水0.1 mL，作為對(duì)照;其余五支各加0.1mL 標(biāo)準(zhǔn)液，室溫放置60 分鐘。用752-C 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于340 nm 測(cè)各管吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y =1806x +3.6398，R2=0.9976

1.5.2 樣品測(cè)試 大鼠280 只，按體重隨機(jī)分為6組:空白組、酒精組、東寶甘泰組、配伍低劑量(生藥3 g/kg)+酒精組、配伍中劑量(生藥6 g/kg)+酒精組、配伍高劑量(生藥12 g/kg)+酒精組?？瞻捉M30 只，其余各組各50 只。實(shí)驗(yàn)分別在4 周末、8 周末、12 周末取材，取材前所有大鼠均禁食不禁水12小時(shí)，用10%水合氯醛350 mg/kg 腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，取少量新鮮血液，經(jīng)抗凝處理。在取血同時(shí)另取肝左葉約0.2 g，立即放入液氮中冷凍，之后置于-70℃冰箱中冷藏，備測(cè)乙醇脫氫酶活性(ADH)。

從每管抗凝血中取出0.25 mL，加生理鹽水0.75 mL，再經(jīng)去蛋白處理，余步驟與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同。根據(jù)吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線求出乙醇質(zhì)量濃度。

1.6 乙醇脫氫酶檢測(cè)

測(cè)試時(shí)用手動(dòng)勻漿器將肝組織在冰水中制成10%勻漿，4℃3000 轉(zhuǎn)/分鐘離心10 分鐘，提取上清液，備檢測(cè)。將測(cè)定ADH 試劑盒內(nèi)的試劑混勻，37℃預(yù)溫10 分鐘，加入待測(cè)液0.05 mL，加入樣本的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，充分混勻，15 秒時(shí)340 nm 處，0.5 cm光徑，測(cè)定OD 值A(chǔ)1，迅速將反應(yīng)液置于37℃水浴鍋中，10分鐘15 秒時(shí)取出，測(cè)定OD 值A(chǔ)2。

計(jì)算公式為:肝組織勻漿中的ADH 活力(U/mgprot)=［測(cè)定(A2-A1)-空白(A2-A1)］÷ (6.22 ×0.5)×［反應(yīng)液總體積(mL)÷樣本量(mL)］÷反應(yīng)時(shí)間×1000÷10%組織勻漿蛋白含量(mgprot/mL)

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)來(lái)表示，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene 檢驗(yàn)，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩均數(shù)間比較采用LSD 法，P ＜0.05 提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為保證檢測(cè)指標(biāo)的客觀真實(shí)性，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)時(shí)剔除不符合正態(tài)分布原則的界外值。

2 結(jié)果

2.1 葛花枳椇子2∶1配伍對(duì)酒精性肝損傷大鼠血中乙醇質(zhì)量濃度的影響

與模型組比較，給藥4 周后，各給藥組大鼠血中乙醇濃度均有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。給藥8 周后，各給藥組大鼠血中乙醇濃度均明顯降低，有顯著性差異，且配伍低劑量組血中乙醇濃度最低，與中劑量組相比(P ＜0.001)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與高劑量組相比(P ＜0.01)，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。給藥12 周后，各給藥組大鼠血中乙醇濃度亦均明顯降低，均有顯著性差異(P ＜0.001)，且配伍低劑量組血中乙醇濃度最低，與中劑量組和高劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 葛花枳椇子配伍對(duì)酒精性肝損傷大鼠血中乙醇濃度的影響

2.2 葛花枳椇子2∶1配伍對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝中乙醇脫氫酶活性的影響

與空白組比較，模型組白酒灌胃4 周(P ＜0.05)、8 周(P ＜0.001)和12 周(P ＜0.001)后，肝中ADH 活性逐漸降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與模型組比較，給藥4 周后，各給藥肝中ADH 活性增強(qiáng)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，其中低劑量組ADH 較高。給藥8 周后，東寶肝泰組(P ＜0.05)和配伍低劑量組(P ＜0.01)ADH 活性增強(qiáng)，有顯著性差異。給藥12 周后，配伍低劑量組(P ＜0.01)ADH 活性增強(qiáng)，有顯著性差異，見(jiàn)表2。

表2 葛花枳椇子配伍對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝中ADH 的影響

3 討論

肝臟是酒精代謝的重要場(chǎng)所，攝入體內(nèi)的乙醇98% ～90%在肝臟內(nèi)氧化，2% ～10%由呼吸道、尿液和汗腺以原形排出;肝臟代謝的乙醇80%通過(guò)乙醇脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙醛，約20%通過(guò)微粒體乙醇氧化酶轉(zhuǎn)化為乙醛，乙醛再經(jīng)乙醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，氧化成二氧化碳和水(CH3CH2OH→CH3CHO →CH3COOH →CO2+ H2O)［5］。目 前ADL 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但認(rèn)為與多種因素有關(guān)［6］。

口服乙醇90% ～98%是通過(guò)以下3 個(gè)途徑代謝［7］:飲酒后，首先啟動(dòng)0 級(jí)經(jīng)典途徑，即通過(guò)胞質(zhì)內(nèi)的乙醇脫氫酶和過(guò)氧化小體內(nèi)的過(guò)氧化氫酶進(jìn)行代謝;當(dāng)血液中乙醇濃度過(guò)高時(shí)，也啟動(dòng)1 級(jí)代謝途徑，即通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的復(fù)合氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行代謝，通過(guò)這3 種途徑將乙醇氧化分解為乙醛。乙醛對(duì)肝臟有直接毒性作用，可以造成肝細(xì)胞脂肪變性壞死等一系列變化。其中ADH 乙醇氧化體系在乙醇代謝中起重要作用。乙醇的肝毒性是由于乙醇脫氫酶介導(dǎo)過(guò)度產(chǎn)生還原型腺嘌呤二核苷酸及有高度毒性的乙醛的結(jié)果。肝細(xì)胞內(nèi)乙醇代謝有三個(gè)主要通路，其中之一是胞漿質(zhì)的ADH 通路。乙醇氧化過(guò)程中會(huì)同時(shí)伴隨2 分子的氧化性輔酶I(NAD+)轉(zhuǎn)化為還原型輔酶I(Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)，這樣導(dǎo)致NADH/NAD 比值增高，進(jìn)而影響了NAD +依賴的過(guò)程，嚴(yán)重干擾了細(xì)胞新陳代謝，使三羧酸循環(huán)受到抑制［8］。此外，乙醇還會(huì)在代謝過(guò)程中促進(jìn)氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，同時(shí)伴隨攝入不足等導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化物減少，促發(fā)氧化應(yīng)激［9］。產(chǎn)生的自由基會(huì)抑制脂肪酸氧化，致使肝細(xì)胞脂肪蓄積。這是引起酒精性脂肪肝的主要原因。NADH 在340 nm 有吸收峰，故本實(shí)驗(yàn)采取測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)生成的NADH 引起的吸收度變化率的方法，測(cè)定ADH 活性的變化。

正常情況下，ADH 在肝臟中含量最高，血清中的ADH 活性是恒定的，只有當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，ADH由肝細(xì)胞內(nèi)釋放入血，從而引起ADH 含量升高，所以檢測(cè)血清中的ADH 活性是診斷某些肝臟疾病的指標(biāo)之一。本研究觀察了葛花枳椇子配伍對(duì)酒后血中乙醇質(zhì)量濃度和肝中乙醇脫氫酶活性的影響。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，模型組大鼠肝組織中乙醇脫氫酶的活性較空白組明顯降低。與模型組比較，給藥4 周后，各給藥組肝中ADH 活性增強(qiáng)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;給藥8 周和12 周后，配伍低劑量組ADH 活性增強(qiáng)，有顯著性差異。

有研究表明乙醇脫氫酶活性的變化可以影響到血中乙醇的濃度。當(dāng)乙醇脫氫酶活性受到抑制或下降時(shí)，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)乙醇的吸收提高，從而加重乙醇對(duì)肝、腎、腦等臟器的損害。本實(shí)驗(yàn)另一研究結(jié)果表明隨著大鼠白酒灌胃時(shí)間的延長(zhǎng)，血中乙醇濃度逐漸升高。給藥治療8 周和12 周后，葛花枳椇子各劑量配伍組均可明顯降低血中乙醇濃度，且至第12 周末，配伍低劑量組血中乙醇濃度最低，顯示一定的治療優(yōu)勢(shì)，提示隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)治療效果越好。

結(jié)合大鼠酒后血中乙醇質(zhì)量濃度和肝中乙醇脫氫酶活性的改變，可以看出給藥8 周和12 周后低劑量組大鼠肝中ADH 活性增強(qiáng)，血中乙醇濃度明顯降低。并且隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，低劑量組可以通過(guò)增強(qiáng)乙醇脫氫酶活性加強(qiáng)肝臟對(duì)乙醇的代謝，降低對(duì)肝臟的損傷而起到一定的保肝效果。

［1］Cohen JI，Nagy LE.Pathogenesis of Mcohohc liver disease:interactions between parenchymal and nonparenchymal cells［J］.J Dig Dis，2011，12(1):3.

［2］厲有名.酒精性肝病的流行病學(xué)特點(diǎn)［J］.實(shí)用肝臟病雜志，2012，15(3):180-182.

［3］卿篤信，凌奇荷.酒精代謝酶與酒精性肝病的關(guān)系研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)·生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，2003，23(3):310.

［4］柳海艷.葛花枳椇子配伍對(duì)酒精性肝損傷的防治作用及機(jī)理探討［D］.北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2011

［5］李先栓.乙醇代謝物的解毒探究［J］.實(shí)驗(yàn)教學(xué)與儀器，2010，(10):36-37.

［6］時(shí)代音，董蕾，魯曉嵐，等.乙酰半胱氨酸對(duì)大鼠酒精性肝病的保護(hù)作用研究［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2012，41(5):519.

［7］You M，Crabb DW.Recent Advances in Alobolic Liver Disease II.Minireview:molecular mechaniams of alcoholic fatty liver［J］.Am J Physial Gastrointest Liver Physiol，2004，287(1):G1-G6.

［8］楊萬(wàn)枝.酒精性肝病發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47(1):97-99.

［9］Tilg H，Moschen AR，Kaneider NC，et al.Pathways of liver injury inalcoholic liver disease［J］.J Hepatol，2011，55 (5 ):1159-1161.