基于偶氮苯的光開(kāi)關(guān)分子探針與傳感芯片研究進(jìn)展欽傳光

魯彩霞等

摘 要 隨著人們對(duì)偶氮苯光致異構(gòu)化反應(yīng)機(jī)制和特性的研究和認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入透徹， 偶氮苯衍生物無(wú)論是在理論上還是在實(shí)驗(yàn)方面都受到了大量的關(guān)注。近年來(lái)， 偶氮苯衍生物作為光開(kāi)關(guān)響應(yīng)的功能元件不僅已經(jīng)用于合成智能聚合物， 液晶材料， 分子開(kāi)關(guān)和分子機(jī)器等， 而且正迅速地滲透到化學(xué)生物學(xué)體系研究和分析的各個(gè)方面。因此， 本文將著重就基于偶氮苯衍生物功能化的光開(kāi)關(guān)型分子探針與傳感芯片及其在化學(xué)生物學(xué)分析研究方面所取得的最新進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)和綜述。引用103篇文獻(xiàn)， 并對(duì)未來(lái)的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 偶氮苯衍生物； 分子探針； 傳感芯片； 生物分析； 光開(kāi)關(guān)； 分子識(shí)別； 綜述

1 引 言

偶氮苯類(lèi)化合物的發(fā)現(xiàn)可以追溯到19世紀(jì)， 迄今已經(jīng)成為化學(xué)化工、食品、醫(yī)藥和輕工等諸多行業(yè)中一類(lèi)舉足輕重的顯色劑、中間體、染料或著色劑[1～3]。偶氮苯1存在兩個(gè)同分異構(gòu)體： 反式（Trans）異構(gòu)1（E）和順式（Cis）異構(gòu)體1（Z）。不同的空間排列導(dǎo)致不同的物理和化學(xué)性質(zhì)。偶氮苯的光致異構(gòu)化反應(yīng)誘發(fā)偶極矩的急劇變化（μ反式偶氮苯 = 0.5 D， 而 μ順式偶氮苯 = 3.1 D）， 進(jìn)而決定了E和Z同分異構(gòu)體疏水和親水特性。反式偶氮苯1（E）不是平面結(jié)構(gòu)， 其二面夾角NNCC大約是17.5°， 而順式偶氮苯1（Z）中一個(gè)苯環(huán)所占據(jù)的平面與另一苯環(huán)的平面呈56°夾角。因此， 偶氮苯的順、反異構(gòu)體中4和4′位置上的兩個(gè)碳原子之間的距離分別是9.0和5.0 。反式偶氮苯1（E）的紫外可見(jiàn)吸收光譜特征由3個(gè)主要的帶組成： （1）在228 nm處的帶源于在苯基上定域的ππ*躍遷； （2） 在318 nm處的帶源于在包括兩個(gè)氮原子的整個(gè)分子上離域的對(duì)稱(chēng)允許ππ*躍遷； （3）在440 nm處的帶源于發(fā)生在中央氮原子上對(duì)稱(chēng)禁阻的nπ*躍遷。值得注意的是， 順式偶氮苯1（Z）的紫外可見(jiàn)吸收光譜相當(dāng)不同于1（E）， 其260 nm的帶源自對(duì)稱(chēng)允許的ππ*躍遷， 而反式異構(gòu)體的這個(gè)帶位于318nm處 [4]（圖1）。

隨著人們對(duì)偶氮苯光致異構(gòu)化反應(yīng)機(jī)制和特性的研究和認(rèn)識(shí)的逐漸深入， 偶氮苯衍生物無(wú)論是在理論上還是在實(shí)驗(yàn)方面都受到了大量關(guān)注。近年來(lái)， 偶氮苯衍生物作為光開(kāi)關(guān)響應(yīng)的功能元件不僅已經(jīng)用于合成智能聚合物[5～7]、液晶材料[8，9]、分子開(kāi)關(guān)[10]和分子機(jī)器[11]， 而且正迅速地滲透到化學(xué)生物學(xué)體系研究和分析的各個(gè)方面[12，13]。本文將著重就基于偶氮苯衍生物功能化的光開(kāi)關(guān)分子探針與傳感芯片及其在化學(xué)生物學(xué)研究方面所取得的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2 偶氮苯衍生物功能化光開(kāi)關(guān)分子探針

小分子偶氮化合物具有光致異構(gòu)的特性， 最近被運(yùn)用于生物系統(tǒng)中作為生物分子（如多肽和蛋白質(zhì)）的“光開(kāi)關(guān)”， 可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽和蛋白質(zhì)分子構(gòu)象進(jìn)行可逆的光化學(xué)操作過(guò)程， 還可以讓多肽和蛋白質(zhì)等生物分子產(chǎn)生有活性與無(wú)活性的轉(zhuǎn)換調(diào)控[14，15]。如圖2所示， RodríguezRedondo等合成了芳香偶氮衍生物2并觀察到其光致順?lè)串悩?gòu)特性， 用波長(zhǎng)410 nm 的光照射反式2（E）， 可以轉(zhuǎn)化為其順式異構(gòu)體。相反， 若用波長(zhǎng)675 nm 的光照射或加熱處理順式2（Z）， 則可以轉(zhuǎn)化為其反式異構(gòu)體2（E）[16]。Siewertsen等研究了橋環(huán)偶氮苯3的光致順?lè)串悩?gòu)特性， 發(fā)現(xiàn)其順式異構(gòu)體3（Z）（黃色）在385 nm光的照射下可轉(zhuǎn)變?yōu)槠浞词疆悩?gòu)體3（E）（紅色）， 而用520 nm光照或加熱處理反式3（E）時(shí)， 可以令其恢復(fù)到3（Z）的順式結(jié)構(gòu)[17]。Kawashima研究組采用鄰位碘代偶氮苯衍生物4為原料， 合成了一系列的芳香偶氮橋雜環(huán)化合物5和6， 并探討了這些化合的環(huán)己烷溶液的熒光激發(fā)性質(zhì)[18]?？梢?jiàn)， 芳香偶氮衍生物經(jīng)功能化后， 可作為光開(kāi)關(guān)， 調(diào)控分子和生物熒光成像劑。

在設(shè)計(jì)合成光控生物分子時(shí)， 偶氮化合物開(kāi)關(guān)的光控異構(gòu)必須考慮以下幾個(gè)問(wèn)題：（1）光致異構(gòu)開(kāi)關(guān)分子必須以某種方式連在生物分子上， 影響生物分子的活性和功能。這取決于作用位點(diǎn)、偶氮開(kāi)關(guān)與多肽或蛋白質(zhì)相連方式和偶氮衍生物的使用類(lèi)型等因素。（2）由于順式和反式異構(gòu)體的吸收光譜有重疊， 照射產(chǎn)生的光穩(wěn)定態(tài)順式異構(gòu)體所占比便最多為80%， 而反式所占比例最多可達(dá)95%。熱致順?lè)闯谠ィ?會(huì)產(chǎn)生約100%的異構(gòu)體。（3）為研究體內(nèi)光控， 異構(gòu)化的波長(zhǎng)必須與細(xì)胞和組織相容。較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光可以較容易地穿透細(xì)胞和組織， 且不被細(xì)胞內(nèi)的其它生物大分子所吸收（如NADH）。（4）偶氮衍生物引入細(xì)胞后必須是穩(wěn)定的， 不能改變或退化； 同時(shí)， 在探測(cè)細(xì)胞過(guò)程中， 它必須經(jīng)歷多次光開(kāi)關(guān)作用。為探索滿(mǎn)足這些要求的新型偶氮光開(kāi)關(guān)分子， 研究者設(shè)計(jì)合成了一系列偶氮苯衍生物， 并將它們與模式多肽交聯(lián)， 研究其調(diào)控生物分子的構(gòu)象和活性特征， 篩選并優(yōu)化偶氮光開(kāi)關(guān)分子結(jié)構(gòu)[19～22]。例如， 以合成的橋環(huán)偶氮苯衍生物作為光開(kāi)關(guān)， 交聯(lián)到α螺旋肽上形成光調(diào)控分子7， 研究其光響應(yīng)特性（圖3）[23]， 發(fā)現(xiàn)7的反式異構(gòu)體可以穩(wěn)定多肽的α螺旋構(gòu)象7（E）， 當(dāng)受到518 nm光照射后， 會(huì)異構(gòu)化而形成順式的7（Z）， 同時(shí)， 肽的α螺旋構(gòu)象遭到破壞而變成無(wú)規(guī)線(xiàn)狀構(gòu)象， 顏色也由反式的紅色變?yōu)轫樖降狞S綠色。而在407 nm光照射下， 又恢復(fù)到α螺旋構(gòu)象7（E）。另外， 也有人合成了一系列的光開(kāi)關(guān)型環(huán)肽， 用于研究光對(duì)環(huán)肽構(gòu)象的調(diào)控變化情況[24，25]。

在有生物活性的分子（如蛋白質(zhì)）中引入偶氮苯分子片段， 能夠使各種不同的生物過(guò)程通過(guò)光照進(jìn)行時(shí)空控制[26～29]?？梢酝ㄟ^(guò)直接時(shí)空調(diào)控酶活性[30]， 多肽、蛋白質(zhì)、核酸[25，31，32]、受體[33～38]、離子通道[39～45]等， 或是通過(guò)調(diào)節(jié)幾種標(biāo)記分子的濃度實(shí)現(xiàn)對(duì)生物過(guò)程的時(shí)空光控。這個(gè)策略是非常有吸引力的， 因?yàn)樗梢钥刂粕锎蠓肿拥臉?gòu)象， 在沒(méi)有添加任何額外試劑的前提下就能以可逆的方式對(duì)生物分子的活性進(jìn)行調(diào)控。由異構(gòu)化引起的結(jié)構(gòu)效應(yīng)能夠被主體放大或引發(fā)一系列的光物理或光化學(xué)的二級(jí)響應(yīng)。偶氮苯在生物學(xué)中的應(yīng)用研究發(fā)端于上世紀(jì)60年代末期， 首次報(bào)道其用于光調(diào)節(jié)胰凝乳蛋白酶（一種消化酶）的活性[46]。后來(lái)， 類(lèi)似的策略被應(yīng)用于煙堿型乙酰膽堿受體功能和結(jié)構(gòu)的研究[47]。4，4′三甲基銨甲基取代偶氮苯從反式到順式異構(gòu)化使乙酰膽堿激動(dòng)劑的濃度升高， 這是因?yàn)閮煞N異構(gòu)體與存在于興奮細(xì)胞膜上的乙酰膽堿受體具有專(zhuān)一的相互作用。以光致順?lè)串悩?gòu)互變的開(kāi)關(guān)方式在細(xì)胞膜上引起生物電脈沖的過(guò)程中允許（或禁阻）離子透膜遷移， 就可能實(shí)現(xiàn)光控調(diào)節(jié)細(xì)胞膜滲透能力的改變。偶氮化合物的異構(gòu)化已經(jīng)作為合成的控件用來(lái)控制細(xì)胞膜上離子通道的閉合， 這對(duì)離子的跨膜運(yùn)輸而言是很重要的。Trauner等實(shí)現(xiàn)了對(duì)神經(jīng)細(xì)胞中K+通道的控制就是一個(gè)具有說(shuō)服力的典型例證。偶氮苯衍生物8是一端被固定在細(xì)胞膜上的末端季銨鹽（圖4）[48]， 因此， 它處于反式構(gòu)象8（E）時(shí)， 其分子長(zhǎng)度讓末端季銨鹽基團(tuán)距離正好封堵在鉀離子通道上， K+的流動(dòng)受到阻礙。用波長(zhǎng)為380 nm的光照射后， 其轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖疆悩?gòu)體8（Z）， 使得芳香苯環(huán)的距離拉近， 縮短了它的分子長(zhǎng)度， 使得末端季銨鹽基團(tuán)的距離無(wú)法有效地阻塞K+通道， 允許K+通過(guò)。光能夠調(diào)節(jié)離子通道系統(tǒng)的活動(dòng)， 這在神經(jīng)生物學(xué)中是很重要的。最近， 馬來(lái)酰亞胺偶氮苯谷氨酸（MAG）9被用作促離子型谷氨酸受體（iGluR）的光致變色激動(dòng)劑（圖5） [49，50]， 這個(gè)發(fā)色團(tuán)包括一個(gè)末端的馬來(lái)酰亞胺單元， 與蛋白質(zhì)通過(guò)半胱氨酸殘基將中心偶氮苯和另一端的谷氨酸共價(jià)連接在一起。只有順式偶氮苯9（Z）才允許谷氨酸片段靠近促離子型谷氨酸受體（iGluR）， 谷氨酸此時(shí)才能與受體蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)相互作用。當(dāng)這種作用發(fā)生時(shí)， 蛋白質(zhì)就像貝殼一樣折疊起來(lái)， 使得離子通道打開(kāi)。而反式的9（E）則無(wú)法拉近谷氨酸與受體蛋白之間的距離， 所以不能有效開(kāi)啟離子通道。利用這種特點(diǎn)， 就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)離子通道進(jìn)行光控調(diào)節(jié)。endprint

在多肽中引入了偶氮苯片段， 用于控制α螺旋肽的構(gòu)象，進(jìn)而通過(guò)這個(gè)偶氮光開(kāi)關(guān)來(lái)光控調(diào)節(jié)在生物分子識(shí)別中非常重要的構(gòu)象間相互作用關(guān)系。含有兩個(gè)半胱氨酸殘基的多肽可以與分子內(nèi)含有兩個(gè)硫醇反應(yīng)活性基團(tuán)的偶氮苯光開(kāi)關(guān)進(jìn)行交聯(lián)， 偶氮苯的異構(gòu)化可以通過(guò)調(diào)節(jié)這兩個(gè)半胱氨酸的空間位置改變多肽的構(gòu)象。當(dāng)α螺旋多肽（如DNA識(shí)別肽）上交聯(lián)的偶氮苯基處于反式時(shí)， 可維持α螺旋構(gòu)象并保持原有功能活性（親和性識(shí)別DNA分子）。光照后， 偶氮苯異構(gòu)化而轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖疆悩?gòu)體， 破壞了多肽的螺旋性構(gòu)象， 就會(huì)抑制或使其喪失原有的功能活性（識(shí)別DNA的親和力下降或不能識(shí)別DNA了）。若再通過(guò)光照使偶氮苯基恢復(fù)其反式結(jié)構(gòu)， 則多肽的構(gòu)象及其功能活性也隨之可逆性地恢復(fù)。2011年， Woolley研究組在靠近偶氮苯基光開(kāi)關(guān)分子的位置連上熒光染料， 偶氮苯基異構(gòu)化， 導(dǎo)致熒光變化， 在斑馬魚(yú)體內(nèi)引入被偶氮苯修飾的生物分子， 證明了偶氮苯的光化學(xué)在體內(nèi)與體外是一樣的， 適當(dāng)?shù)呐嫉窖苌镌隗w內(nèi)的穩(wěn)定性可以保持?jǐn)?shù)天[51， 52]。

偶氮苯衍生物作為分子探針的另外一個(gè)重要應(yīng)用是在熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）體系中承擔(dān)熒光淬滅劑的角色。如4（4′二甲氨基苯基偶氮）苯甲?；―abcyl）和4二甲氨基偶氮苯4′磺酰基（Dabsyl）是兩種最常見(jiàn)的非熒光受體（可作為熒光淬滅劑）， 最大吸收波長(zhǎng)分別為 458和 466 nm。其它的偶氮苯衍生物淬滅劑系列還包括 黑洞淬滅劑（Black hole quencher， BHQ）和多路淬滅劑（Multipath quencher， MPQ）[53]。這些淬滅劑有較寬的吸收光譜， 這使它們能作為很多種染料的受體。淬滅劑經(jīng)常被應(yīng)用于 DNA 分析， 特別是作為受體和有機(jī)染料供體共同構(gòu)建分子信標(biāo)[54～56]。這一體系的主要優(yōu)點(diǎn)是只觀測(cè)供體分子的信號(hào)， 如果光譜范圍區(qū)分明顯， 還可以與其它供體淬滅劑體系共同分析。除了基于 DNA 的診斷， 分子信標(biāo)還用于測(cè)量高分子電解質(zhì)薄膜對(duì) DNA 的通透性[57]， 有催化活性的 DNA 生物傳感器還可以檢測(cè)Pb2+[58]。淬滅劑標(biāo)記的底物類(lèi)似物和染料標(biāo)記的蛋白質(zhì)被共同用于制備基于 FRET的糖類(lèi)傳感器，可實(shí)現(xiàn)對(duì)血液檢驗(yàn)、食品加工以及發(fā)酵制品中糖類(lèi)化合物的分析與監(jiān)測(cè)[59]。

3 偶氮苯衍生物分子識(shí)別的傳感芯片

超分子化學(xué)是兩個(gè)或多個(gè)化學(xué)物種借分子間的弱相互作用力形成的實(shí)體或聚集體的化學(xué)， 現(xiàn)已成為發(fā)展迅速、極富挑戰(zhàn)性的新領(lǐng)域。主客體化學(xué)是超分子化學(xué)的重要分支，其主要研究對(duì)象是客體分子（底物）和主體分子（受體）之間的特異性結(jié)合，并產(chǎn)生某種特定功能的過(guò)程，以及這種結(jié)合對(duì)兩者造成的影響。特異性結(jié)合是分子組裝及其功能化中的關(guān)鍵過(guò)程，也是酶和受體專(zhuān)一選擇性的基礎(chǔ)。偶氮苯的光致變色特性在“主體客體”分子識(shí)別方面同樣有應(yīng)用。例如， 雙偶氮化合物10通過(guò)氫鍵間的相互作用作為胍鹽離子很好的受體。當(dāng)偶氮苯為順式構(gòu)象10（Z，Z）時(shí)， 這種識(shí)別是很有效的[60，61]。芳香偶氮衍生物可以作為超分子化學(xué)的主體識(shí)別并捕獲某些有機(jī)小分子， 如圖6所示， 順式偶氮苯衍生物10（Z）和11（Z）可以捕獲小分子而形成超分子復(fù)合物， 受可見(jiàn)光（440 nm）照射， 異構(gòu)為其反式結(jié)構(gòu)10（E）和11（E）后， 將小分子釋放出來(lái)[62]。

Pearson等[63]合成了偶氮苯的衍生物12并把它固定在SPR芯片上（圖7，左）， 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)12（E）本身不能與蛋白酶親和識(shí)別， 但紫外光照射芯片后， 12（E）異構(gòu)化轉(zhuǎn)變?yōu)槠漤樖疆悩?gòu)體就能親和識(shí)別蛋白酶了。偶氮苯衍生物的順式異構(gòu)體13（Z）通過(guò)其兩端的寡聚核苷酸片段序列與DNA分子中的互補(bǔ)序列相互識(shí)別，能夠結(jié)合成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。而在可見(jiàn)光照射下，異構(gòu)化為其反式異構(gòu)體13（E）后，就只能通過(guò)一端的序列與DNA識(shí)別，不能形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖7，右）。另一方面， 偶氮苯及其衍生物又可以是另一些分子如沸石[64，65]、杯芳烴[66～70]、有機(jī)無(wú)機(jī)超分子通道架構(gòu)[71]和環(huán)糊精[72～74]等的超分子識(shí)別對(duì)象（或客體） （圖8）。特別是芳香偶氮衍生物與環(huán)糊精的超分子化學(xué)研究開(kāi)展得相當(dāng)活躍， 在應(yīng)用方面也取得了顯著進(jìn)展。

環(huán)糊精作為超分子化學(xué)主體可以選擇性地識(shí)別反式偶氮苯及其衍生物， 而不能接納其順式異構(gòu)體。利用這種可逆的超分子識(shí)別作用和偶氮化合物的光致異構(gòu)特性， 人們?cè)O(shè)計(jì)并制備了許多基于偶氮化合物的光敏芯片和智能材料， 用于化學(xué)分離、藥物遞送系統(tǒng)以及生物醫(yī)學(xué)分析。Harada等[75]設(shè)計(jì)了這樣一種單分子層信號(hào)輸入和讀出的超分子系統(tǒng)， β環(huán)糊精附于金電極上形成活性界面， 在不同的紫外光照下， 偶氮苯衍生物可與超分子β環(huán)糊精進(jìn)行主客體識(shí)別而被包裹或釋放， 這樣就對(duì)信號(hào)進(jìn)行了不同的處理。分子印跡材料是用模板分子在基質(zhì)表面形成分子印跡所制備的材料，已廣泛應(yīng)用于分離分析和傳感器等方面。表面光響應(yīng)分子印跡材料由于其生色團(tuán)的存在可光控的攝取或釋放分子模板， 這種新型表面印跡系統(tǒng)可通過(guò)光控手段提高印跡材料的選擇性和分離效率。Wang等[76]設(shè)計(jì)合成了被偶氮基團(tuán)功能化的聚醚砜（PES）微纖維， 其中4HA作為分子模板， 它與被偶氮功能化的氨基之間主要的作用是靜電引力和氫鍵作用。在450 nm的光照下， PES結(jié)合4HA， 在365 nm的紫外光照下PES釋放4HA。聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面的功能化得到的材料由于其無(wú)毒、易得、良好的光透明性和透氣性等優(yōu)勢(shì)在生物醫(yī)學(xué)和生物分子領(lǐng)域有很大的應(yīng)用。尤其是基于PDMS的微流體器件在生物合成、疾病診斷、DNA測(cè)序、蛋白質(zhì)結(jié)晶、細(xì)胞的生物分析等方面極具吸引力。若將偶氮苯的分子識(shí)別從不可逆變得可逆， 就會(huì)使得其在生物芯片應(yīng)用方面顯示更為獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Zhang等[77]利用表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（SIATRP）， 通過(guò)偶氮苯和環(huán)糊精之間的主客體識(shí)別相互作用改性PDMS的表面。通過(guò)五步反應(yīng)改性了PDMSPEGCD表面。被羅丹明B標(biāo)記的偶氮苯和被熒光素FITC標(biāo)記的偶氮苯與PDMSPEGCD表面在紫外和可見(jiàn)光的照射下進(jìn)行可逆的組裝和分解。首先被標(biāo)記的反式偶氮苯與表面的PDMSPEGCD在無(wú)光下作用12 h， 之后在365 nm的紫外光照射下兩者再次分離， 如圖9A所示。endprint

在光電傳感器件的設(shè)計(jì)制備方面， 能夠識(shí)別特異性互補(bǔ)的客體分子的智能納米管已廣受關(guān)注， 并且在主客體化學(xué)研究領(lǐng)域掀起了研究熱潮。Banerjee等[78]研究并探討了偶氮苯修飾的納米管和αCD與金層結(jié)合的自組裝單層膜（αCDSAM）之間的主客體相互作用。首先合成偶氮苯納米管：羥基偶氮苯羧酸（HABA）上的羧基和多肽納米管中的氨基之間通過(guò)氫鍵作用， 在4 ℃避光反應(yīng)48 h后即可制得。制備αCDSAM：將硫醇化的αCD自組裝于金層上形成αCDSAM， 反式偶氮苯納米管因被αCDSAM識(shí)別而固定在金的表面。在360 nm的紫外光照5 h， 轉(zhuǎn)變成了順式偶氮苯納米管， 就會(huì)從αCDSAM上分離， 即順式偶氮苯結(jié)構(gòu)使得偶氮αCD復(fù)合物分解， 納米管從基質(zhì)表面移去。這是一個(gè)可逆過(guò)程， 當(dāng)在無(wú)光下照射24 h，偶氮苯納米管通過(guò)主客體識(shí)別作用與αCDSAM又會(huì)重新結(jié)合， 使得傳感芯片表現(xiàn)出智能性， 如圖9B所示。

這些智能納米管能夠有效阻止蛋白質(zhì)不可逆地粘附在其表面的材料， 在生物傳感、生物醫(yī)學(xué)移植、體外診斷以及靶向藥物遞送的載體等方面都有廣泛應(yīng)用。在多種抗蛋白質(zhì)粘附的材料中， 基于PEG的材料幾十年來(lái)都被用于阻抗非特異性蛋白質(zhì)的吸附或細(xì)胞粘附。然而， 要想設(shè)計(jì)出具有反應(yīng)活性的可固定的生物界面， 使得其能夠?qū)ν饨绱碳ぎa(chǎn)生響應(yīng)， 并可逆地阻止蛋白質(zhì)吸附， 這依然是一個(gè)挑戰(zhàn)性的問(wèn)題。Wan等[79]致力于將該過(guò)程進(jìn)行可逆化控制， 他們利用含偶氮苯的自組裝單體（Azo SAM）和pH值響應(yīng)的嵌段共聚物之間的主客體相互作用， 設(shè)計(jì)合成了pH值響應(yīng)的反應(yīng)活性生物界面。其中pH值響應(yīng)的嵌段共聚物（PEGPAAgCD）是通過(guò)在PEG丙烯酸嵌段共聚物上接枝β環(huán)糊精制備的， 再通過(guò)材料表面固定的偶氮苯與含環(huán)糊精的PEGPAAgCD之間主客體識(shí)別相互作用進(jìn)行自組裝， 即形成了PEGPAAgCD的PH響應(yīng)生物界面。隨著pH值變化， 該界面能在延展態(tài)和弛豫態(tài)之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換， 前者處于pH=7的負(fù)電狀態(tài)， 結(jié)合細(xì)胞色素c， 后者處于pH=4的電中性， 能阻止界面對(duì)細(xì)胞色素的吸附， 該過(guò)程實(shí)現(xiàn)了可逆化， 如圖9C所示。

在組織工程研究中， 細(xì)胞粘附和遷移是最基本的細(xì)胞行為， 其調(diào)控過(guò)程是可以通過(guò)細(xì)胞膜上的整合蛋白與結(jié)合在聚合物支架上一些特異性生物分子之間的非共價(jià)相互作用實(shí)現(xiàn)的， 這些特異性生物分子是指諸如層粘連蛋白、纖維連接蛋白和含精氨酸甘氨酸天冬氨酸（RGD）序列的多肽。為了改善聚合物支架對(duì)特定細(xì)胞的識(shí)別性粘附， 人們嘗試了各種方法開(kāi)發(fā)仿生生物界面， 其中自組裝單層膜（SAMs）技術(shù)可以有效地在材料表面引入細(xì)胞粘附因子。Gong等[80]利用偶氮苯的光致異構(gòu)特性在材料表面構(gòu)筑了基于自組裝單層膜（SAM）的“智能芯片”?！爸悄苄酒笔怯赡┒诉B接鏈狀烷基硅烷的αCD與偶氮苯甘氨酸精氨酸天冬氨酸絲氨酸（azoGRGDS）通過(guò)偶氮苯和環(huán)糊精的主客體識(shí)別進(jìn)行自組裝形成的， 由于存在RGD序列， 這種智能表面可粘附細(xì)胞。在加熱或可見(jiàn)光照射下， 偶氮苯會(huì)處于反式構(gòu)象， 粘附有細(xì)胞的偶氮苯GRGDS就與芯片表面上的αCD發(fā)生自組裝， 這樣就能把細(xì)胞固定在芯片表面了。而在紫外光的照射下， 則轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖脚嫉紾RGDS細(xì)胞的部分就會(huì)脫離芯片表面上的αCDSAMs， 而且這個(gè)過(guò)程可實(shí)現(xiàn)可逆化， 如圖9D所示。

最近， Frasconi等[81]利用偶氮苯的光致互變異構(gòu)效應(yīng)及其順?lè)串悩?gòu)體對(duì)環(huán)糊精選擇性主客體識(shí)別作用， 在金納米粒表面構(gòu)建了固定二茂鐵的分子微陣列傳感芯片， 通過(guò)電化學(xué)氧化還原控制組裝和邏輯門(mén)操控， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)溶液中環(huán)糊精接枝聚合物捕獲與釋放的可逆控制， 用于分離和純化溶液中的偶氮苯衍生物， 這在水的凈化處理和靶向遞藥方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。此外， 利用偶氮苯環(huán)糊精主客體識(shí)別體系， 人們還開(kāi)發(fā)出了其它光控智能材料[82]。

4 結(jié)論與展望

偶氮苯在上世紀(jì)就已為人所知， 研究者對(duì)其性能進(jìn)行了深入的研究。20世紀(jì)70年代它已經(jīng)被應(yīng)用于生物領(lǐng)域， 但直到最近人們才注意到偶氮苯光控開(kāi)關(guān)有對(duì)生物體進(jìn)行光控的潛力。目前為止主要的挑戰(zhàn)依然是以下兩個(gè)方面：（1）如何使長(zhǎng)波開(kāi)關(guān)體現(xiàn)出較大構(gòu)象變化， 同時(shí)維持其獨(dú)特的開(kāi)關(guān)性能（2）如何轉(zhuǎn)化偶氮苯的光致異構(gòu)化過(guò)程， 使生物分子具有較大的結(jié)構(gòu)和功能轉(zhuǎn)變。雖然， 對(duì)偶氮苯衍生物的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性進(jìn)行了較為廣泛的研究， 但其分子過(guò)程依然不為人們所熟知。偶氮苯光開(kāi)關(guān)的使用為化學(xué)生物學(xué)的分析方法提供了新思路， 分析并解釋了一些生物與生理學(xué)問(wèn)題， 但在化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的分析和檢測(cè)方面， 其應(yīng)用潛力還有待于深入研究和開(kāi)發(fā)。

目前， 大多數(shù)偶氮苯光控開(kāi)關(guān)分子探針和傳感芯片的應(yīng)用還很少涉及對(duì)體內(nèi)生物分子功能的光控。為了進(jìn)行生物學(xué)功能的體內(nèi)光控實(shí)驗(yàn)， 人們既要用光開(kāi)關(guān)修飾特定的生物分子， 引入生物體內(nèi)（如使用顯微注射技術(shù)或是膜穿透肽序列）[91～94]， 又要有選擇性的靶分子。Trauner等使用后面的方法定向研究細(xì)胞膜胞外域上的離子通道[95，96]， 認(rèn)為這種離子通道的選擇性是由特定的配體/蛋白間相互作用而提供的。使用偶氮苯光開(kāi)關(guān)對(duì)細(xì)胞內(nèi)特定靶分子進(jìn)行修飾時(shí)，要求細(xì)胞膜必須對(duì)這種開(kāi)頭分子具有通透性， 如果對(duì)靶分子進(jìn)行共價(jià)修飾， 還需要它能夠進(jìn)行生物正交反應(yīng)[97，98]。

當(dāng)然， 為在體內(nèi)發(fā)揮作用， 偶氮苯光開(kāi)關(guān)在還原性的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中必須有相當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)穩(wěn)定性。細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電位由谷胱甘肽（三肽）維持， 其濃度為1～10 mmol/L[99]。該還原機(jī)制還涉及到偶氮雙鍵上谷胱甘肽巰基的進(jìn)攻所形成的甲硫基酰肼的加合物。此類(lèi)物質(zhì)能與第二個(gè)谷胱甘肽分子反應(yīng)氧化谷胱甘肽形成非光開(kāi)關(guān)性的肼類(lèi)化合物。該反應(yīng)的速率取決于谷胱甘肽的濃度， 修飾后的生物分子濃度以及偶氮苯還原電位。

偶氮苯光開(kāi)關(guān)的其它現(xiàn)象表明， 減少以上條件可以使其在細(xì)胞內(nèi)部更為穩(wěn)定。Woolley等在體外模擬生理?xiàng)l件下， 在一些氨基偶氮苯中加入較高濃度的谷胱甘肽， 孵育一夜， 并沒(méi)有使其含量減少[100]。在大腸桿菌代謝活性蛋白中加入苯基偶氮苯丙氨酸可以光控抑制反義密碼子的形成。修飾蛋白的成功制備說(shuō)明了在體內(nèi)表達(dá)過(guò)程中含有苯基偶氮苯丙氨酸的多肽（PAP）是較為穩(wěn)定的。Zhang等[101]研究了光開(kāi)關(guān)性環(huán)孢素A的翻譯過(guò)程， 它含有二氨基偶氮苯基開(kāi)關(guān)， 對(duì)谷胱甘肽的還原具有耐受性， 將其溶解在人體血液中可以進(jìn)行光致異構(gòu)過(guò)程。當(dāng)然， 除了谷胱甘肽介導(dǎo)的還原可以導(dǎo)致偶氮苯光控開(kāi)關(guān)的減少外， 還有其它路徑。酶介導(dǎo)的還原和其它修飾均有多種偶氮染料參與[102，103]。酶介導(dǎo)還原不僅取決于偶氮苯衍生物的氧化還原能力， 還與苯環(huán)上的取代基有關(guān)。許多證據(jù)表明， 偶氮苯光開(kāi)關(guān)性在體內(nèi)是可以持續(xù)的， 因?yàn)樵谀撤N情況下偶氮苯光開(kāi)關(guān)可以改變細(xì)胞的功能。endprint

Woolley等[102]將熒光信號(hào)直接加入偶氮苯光開(kāi)關(guān)中以便在體內(nèi)直接讀出偶氮苯光開(kāi)關(guān)。他們制備了一種熒光指示體系， 他們將二氨基偶氮苯光開(kāi)關(guān)交聯(lián)到一個(gè)N末端含有熒光的α螺旋肽。UV照射引起反式順式異構(gòu)體轉(zhuǎn)變可以導(dǎo)致熒光強(qiáng)度隨時(shí)間而減少。藍(lán)光照射引起順式反式異構(gòu)體轉(zhuǎn)變可以導(dǎo)致熒光強(qiáng)度隨時(shí)間而增加。將這種結(jié)構(gòu)注射到斑馬魚(yú)的胚胎中， 觀察整個(gè)生物體（即在各種不同類(lèi)型的細(xì)胞中）， 其光開(kāi)關(guān)可以持續(xù)至少2天。使用與體外相同的方法測(cè)量開(kāi)關(guān)速率、量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性。以上結(jié)果表明， 選擇適當(dāng)?shù)呐嫉窖苌锟商綔y(cè)體內(nèi)生理過(guò)程。例如， 光開(kāi)關(guān)性多肽和蛋白能夠探測(cè)斑馬魚(yú)早期發(fā)育的生理模式。這些研究工作為采用偶氮苯光控開(kāi)關(guān)分子探針和傳感芯片直接監(jiān)測(cè)或?qū)崟r(shí)調(diào)控生物體內(nèi)的生物學(xué)過(guò)程奠定了基礎(chǔ)并開(kāi)拓了方向， 必將促進(jìn)分析化學(xué)與生物分析方法學(xué)的創(chuàng)新與發(fā)展。

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Abstract Azobenzene derivatives have received considerable experimental and theoretical attention， along with more and more the investigation and the knowledge on the characteristics of their photoinduced isomerization. Except for their traditionally wellknown uses as dyes or colorants in many industries， in recent years， azobenzene derivatives have been widely used as photoresponsive functional devices utilized not only as smart polymers， liquid crystals， molecular switches， and machines， which have been reviewed in several reports. Simultaneously， they also have been rapidly permeated and applied to the field of chemical and biological analysis as photoswitchable molecular probes and sensory chips， playing an increasingly significant role. So， it is worth emphasizing to review and summarize the last developments in the later topics as title of this paper. More than 100 relevant literatures are cited here and the prospects are pointed out.

Keywords Azobenzene derivative； Molecular probe； Sensory chip； Bioanalysis and imaging； Photoswitching agent； Molecular recognition； Review

（Received 8 October 2014； accepted 22 December 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 20672086， 20802057） and the Natural Science Basic Research Plan in Shaanxi Province of China （No. 2012JZ2002）endprint