磁性粒子表面自組裝辛可寧分子印跡電致化學(xué)發(fā)光傳感器

魏小平等

摘 要 以辛可寧為模板分子、十二烷基硫醇為功能單體，在Fe3O4@Au納米粒子表面自組裝辛可寧分子印跡膜，構(gòu)建了新型磁性粒子分子印跡電化學(xué)發(fā)光傳感器。通過(guò)透射電子顯微鏡對(duì)磁性納米粒子的粒徑分布及形貌進(jìn)行了表征，使用紅外光譜對(duì)比分析了辛可寧、分子印跡膜洗脫前和洗脫后的結(jié)構(gòu)及成分。結(jié)果表明，在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下（0.012 mol/L 硼砂緩沖溶液（pH 9.5），0.8 mmol/L Ru（bpy）2+3），辛可寧濃度的對(duì)數(shù)在1 × 10 10～9 × 10 8 mol/L范圍內(nèi)，與電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化值有良好的線性關(guān)系，檢出限為3.5×10 11 mol/L。此傳感器靈敏度高、選擇性好、易于更新，將其用于血清樣品的檢測(cè)，方法回收率為98.8%～104.7%。

關(guān)鍵詞 分子印跡傳感器； 磁性納米粒子； 辛可寧； 自組裝； 電致化學(xué)發(fā)光

1 引 言

分子印跡傳感器具有對(duì)目標(biāo)分子專一識(shí)別的特性以及良好的機(jī)械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，近年來(lái)受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注[1～4]。分子印跡傳感器的合成方法通常是使目標(biāo)分子、功能單體以及交聯(lián)劑三者之間發(fā)生三維聚合反應(yīng)，經(jīng)洗脫模板分子后，留下對(duì)目標(biāo)分子具有較高選擇性和親和力的識(shí)別位點(diǎn)。然而，傳統(tǒng)制備方法所得到的印跡傳感器每次使用后需要進(jìn)行印跡膜的更新，繁瑣、費(fèi)時(shí)，且重現(xiàn)性差[5～7]。

磁性Fe3O4納米粒子不僅具有諸多納米材料的優(yōu)點(diǎn)，而且還具有超順磁效應(yīng)，在外加磁場(chǎng)的作用下，能夠快速實(shí)現(xiàn)電極敏感膜的更新。利用磁性粒子作為載體， 制備易更新的分子印跡傳感器備受關(guān)注[8～10]。自組裝分子印跡技術(shù)[11]是指功能單體與模板分子之間通過(guò)非共價(jià)鍵作用（如氫鍵、靜電力、疏水作用力、范德華力等）在溶液中自發(fā)的形成單體模板分子穩(wěn)定復(fù)合物的方法，它結(jié)合了分子印跡和自組裝技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，已被眾多學(xué)者研究[12]。

辛可寧（Cinchonin，CCN）是一種喹啉類生物堿，具有抗心律失常、抗瘧等作用。但辛可寧使用不當(dāng)，會(huì)引起人體中毒，出現(xiàn)頭痛、暈眩、耳鳴、惡心、視力及聽力減退等癥狀。目前對(duì)辛可寧的檢測(cè)方法也有報(bào)導(dǎo)[13～17]。如文獻(xiàn)[13]利用傳統(tǒng)電聚合法制備的辛可寧分子印跡膜傳感器的膜更新比較困難，且聚合物印跡膜較厚導(dǎo)致電子傳遞速率慢、傳感器靈敏度不高。

本研究在Fe3O4@Au磁性納米粒子表面自組裝辛可寧分子印跡膜，利用辛可寧分子與底液中Ru（bpy）2+3發(fā)生共反應(yīng)以增強(qiáng)其電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的原理，采用電化學(xué)發(fā)光（ECL）的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)辛可寧的測(cè)定。此磁性粒子自組裝分子印跡膜傳感器不僅檢測(cè)靈敏度較已報(bào)導(dǎo)的辛可寧傳感器高，而且利用自組裝方法所制備的分子印跡膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有序，識(shí)別過(guò)程擴(kuò)散阻礙少，響應(yīng)快。此外，通過(guò)施加或移除外加磁場(chǎng)，實(shí)現(xiàn)電極表面的快速更新， 有效地克服了傳統(tǒng)印跡方法中模板分子洗脫困難的缺點(diǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

MPIE型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)（西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司）； 電致化學(xué)發(fā)光采用三電極系統(tǒng)：工作電極為磁控玻碳電極，參比電極為Ag/AgCl（飽和KCl）電極，對(duì)電極為鉑絲電極。Bransonic200 超聲儀（德國(guó)Branson Ultraschall公司）； pHS2C型精密酸度計(jì)（上海雷磁精密儀器有限公司）； GS28B電子恒速攪拌器（上海安亭電子儀器廠）； DK8B型電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

辛可寧（上?；瘜W(xué)試劑站）； 三聯(lián)吡啶氯化釕六水合物（百靈威科技有限公司）； 氯金酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 硼砂緩沖液由0.01 mol/L H3BO3和0.1 mol/L NaOH配制。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

2.2 磁性納米粒子Fe3O4@Au的制備

參照文獻(xiàn)[18]方法合成Fe3O4@Au核殼結(jié)構(gòu)的納米微粒。稱取適量FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O，以Fe3+/Fe2+=1∶2的摩爾比混合，并溶解在水中，50 ℃恒溫水浴下高速攪拌，勻速加入適量NaOH，調(diào)節(jié)至pH 10后，升溫至80 ℃繼續(xù)攪拌1 h。整個(gè)實(shí)驗(yàn)均在 N2保護(hù)下進(jìn)行。制備的黑色懸浮液超聲20 min后，磁鐵分離，用水反復(fù)洗滌，定容，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取0.229 g檸檬酸鈉溶解在100 mL水中，攪拌下加熱，至99 ℃時(shí)迅速加入1 mL上述制備的磁性Fe3O4納米粒子，攪拌片刻，加入5 mL 10 mmol/L氯金酸溶液，繼續(xù)加熱并攪拌15 min，移去熱源后繼續(xù)攪拌15 min，待淺棕紅色溶液冷卻到室溫后，通過(guò)外加磁場(chǎng)進(jìn)行分離，并用水清洗后定容到20 mL，得Fe3O4@Au貯備液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 磁性納米粒子Fe3O4@Au表面自組裝分子印跡膜及非分子印跡膜的制備

先將適量上述Fe3O4@Au溶液加入到5 mmol/L 辛可寧乙醇溶液中，超聲振蕩10 min，室溫下靜置12 h，確保辛可寧分子通過(guò)靜電作用吸附到Fe3O4@Au納米粒子表面； 接著，向上述混合液中加入15 μL十二烷基硫醇，搖勻，室溫條件下自組裝12 h； 最后，依次用甲醇乙酸（3∶1， V/V）溶液和水洗脫模板分子，即可在Fe3O4@Au表面得到自組裝的辛可寧分子印跡膜（Molecularly imprinted membrane， MIM）。用同樣的方法制備非分子印跡膜（nMIM），只是在制備過(guò)程中不添加模板分子辛可寧。

2.4 電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法

電極在使用之前，先使用0.05 μm的Al2O3粉末研磨拋光電極表面，然后分別置于50%（V/V）HNO3、無(wú)水乙醇、水中超聲清洗，晾干備用。

移取5 μL修飾了分子印跡膜的Fe3O4@Au，滴加到磁控玻碳電極表面，以此為工作電極。電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)是將電極置于不同濃度的辛可寧溶液中進(jìn)行重吸附后，浸入到含有0.8 mmol/L三聯(lián)吡啶釕的12 mmol/L硼砂緩沖液（pH=9.5）中，直接測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。電致化學(xué)發(fā)光參數(shù)設(shè)定為： 掃描電位為0.2～1.3 V，掃描速率為100 mV/s，光電倍增管高壓為 900 V，放大級(jí)數(shù)為4級(jí)。endprint

2.5 樣品處理方法

志愿者的人體血清樣品取自桂林理工大學(xué)醫(yī)院。移取血清樣本5 mL，加入5 mL過(guò)飽和（NH4）2SO4，攪拌5 min，3000 r/min 離心10 min，除去雜質(zhì)蛋白，取上清液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3 結(jié)果與討論

3.1 核殼型Fe3O4@Au磁性粒子的表征采用紅外光譜法對(duì)分子印跡膜洗脫前后進(jìn)行了表征。圖2a為辛可寧的紅外譜圖，3442.30 cm 1為OH的伸縮振動(dòng)峰，1637.23 cm 1為辛可寧中CN的伸縮振動(dòng)峰，1112.84 cm 1為辛可寧CN的伸縮振動(dòng)峰； 圖2b為分子印跡膜的紅外光譜圖，分子印跡膜中含有辛可寧的特征峰，當(dāng)洗脫模板分子辛可寧后，紅外光譜中辛可寧的特征峰消失（圖2c），由此可以證明，模板分子被成功移除。

3.2 傳感器的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)

電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)是利用辛可寧含有的叔氨基對(duì)Ru（bpy）2+3的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)有增敏作用的原理對(duì)辛可寧進(jìn)行檢測(cè)。傳感器在不同條件下的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)見圖3。由圖3可知，修飾了分子印跡膜的電極，未洗脫模板分子時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度較大（曲線a）； 而洗脫模板分子后，發(fā)光強(qiáng)度明顯減小（曲線b）。這是由于未洗脫模板分子前，膜內(nèi)含有較多的辛可寧分子，其結(jié)構(gòu)中的叔氨基能夠有效增強(qiáng)Ru（bpy）2+3的發(fā)光強(qiáng)度； 而洗脫模板分子后，膜內(nèi)幾乎無(wú)辛可寧分子，從而使得發(fā)光強(qiáng)度明顯減小。 對(duì)不同濃度的辛可寧進(jìn)行重吸附，隨著吸附辛可寧量的增加，Ru（bpy）2+3的發(fā)光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)（曲線c和d）。

反之， 對(duì)于非分子印跡膜電極來(lái)說(shuō)（見圖3插圖）。在電極表面形成一層致密的非分子印跡膜時(shí)，由于nMIM電子傳遞阻礙大，且膜內(nèi)無(wú)模板分子辛可寧，不能促進(jìn)Ru（bpy）2+3發(fā)光，故發(fā)光強(qiáng)度極?。ㄇ€e）。經(jīng)洗脫處理后，發(fā)光強(qiáng)度幾乎不變（曲線f）?？梢娤疵撉昂髇MIM中都不存在印跡位點(diǎn)。

3.3 緩沖溶液的優(yōu)化

分別考察了PBS、TrisHCl和硼砂3種緩沖溶液對(duì)體系ECL響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，在硼砂緩沖溶液中，傳感器的ECL響應(yīng)最好。進(jìn)一 步考察了不同pH硼砂緩沖液對(duì)體系ECL響應(yīng)的影響。當(dāng)硼砂緩沖溶液pH=9.5時(shí)，傳感器的發(fā)光效果最好，故選擇pH 9.5進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)還考察了硼砂緩沖液濃度對(duì)體系ECL響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，硼砂緩沖溶液濃度為12 mmol/L時(shí)， 體系ECL響應(yīng)最高。

3.4 聯(lián)吡啶釕濃度的影響

考察了Ru（bpy）2+3濃度對(duì)ECL響應(yīng)強(qiáng)度的影響。在0.3～1.0 mmol/L范圍內(nèi)，當(dāng)Ru（bpy）2+3濃度較低時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度很弱，其原因可能是此時(shí)參與共反應(yīng)的Ru（bpy）2+3不足，導(dǎo)致了發(fā)光強(qiáng)度較低、靈敏度不高的現(xiàn)象； 隨著Ru（bpy）2+3濃度增加，發(fā)光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，但當(dāng)Ru（bpy）2+3濃度過(guò)高時(shí)，電化學(xué)反應(yīng)中生成的不穩(wěn)定中間體Ru（bpy）3+3也較多，從而導(dǎo)致基線不穩(wěn)， 峰形變差，所以Ru（bpy）2+3 濃度選擇為0.8 mmol/L。

3.6 分子印跡傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性分析

用同一支傳感器對(duì)7×10 9 mol/L辛可寧連續(xù)測(cè)定5次，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)相對(duì)偏差為2.5%（濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%）； 同一批次的5支傳感器對(duì)7×10 9 mol/L辛可寧進(jìn)行測(cè)定，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)偏差為3.8%（濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.9%），說(shuō)明此傳感器有較好的重現(xiàn)性。為考察傳感器的穩(wěn)定性，使傳感器重吸附7×10 9 mol/L辛可寧溶液后，置于4 ℃下保存，定期檢測(cè)電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的變化。一星期內(nèi)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度幾乎不變，兩星期之后，發(fā)光強(qiáng)度減少了4.7%，說(shuō)明傳感器的穩(wěn)定性較好。

3.7 分子印跡傳感器的特異識(shí)別性分析

為了研究傳感器的特異性識(shí)別能力，考察了辛可寧結(jié)構(gòu)類似物、血清樣品中常見有機(jī)物質(zhì)及常見離子對(duì)傳感器選擇性的影響。結(jié)果表明，200倍濃度的左旋咪唑； 100倍濃度的奎寧、奎寧丁、抗壞血酸、多巴胺、葡萄糖、色氨酸、苯丙氨酸以及不同濃度倍數(shù)的常見離子（表1）對(duì)傳感器識(shí)別1×10 9 mol/L辛可寧的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)信號(hào)變化影響小于5%，說(shuō)明此傳感器對(duì)辛可寧具有較好的特異性識(shí)別能力。此傳感器敏感層的形成是將模板分子CCN通過(guò)靜電作用吸附在Fe3O4@Au表面，加入十二烷基硫醇后，通過(guò)AuS鍵自組裝在金殼表面，利用十二烷基硫醇與模板分子CCN之間的分子間作用力將印跡結(jié)構(gòu)固定，洗脫模板分子CCN后，在印跡膜上留下與CCN結(jié)構(gòu)及大小相互匹配的印跡位點(diǎn)，使得MIM對(duì)CCN產(chǎn)生特異性選擇識(shí)別。

3.8 樣品檢測(cè)及回收率

按照實(shí)驗(yàn)方法，將傳感器置于處理好的樣品中進(jìn)行重吸附，測(cè)定電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，方法的回收率為98.8%～104.7%，相對(duì)偏差小于2.7%。

結(jié)果表明， 此傳感器制備過(guò)程簡(jiǎn)單、易更新、靈敏度高、選擇性好，適用于血清樣品中辛可寧的檢測(cè)。

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Abstract A molecularly imprinted electrochemiluminescence sensor for detection of cinchonine based on surface selfassembly of molecularly imprinted membrane on magnetic nanoparticles was developed. Cinchonine was used as template and lauryl mercaptan was used as assembling monomer. The morphology and particle size distribution of the magnetic nanoparticles were characterized by TEM， and the infrared spectroscopy was used to study the structure and composition of cinchonine， molecularly imprinted membrane before and after elution. The results showed that， cinchonine could be specifically assayed with a linear relationship between the signal intensity and the logarithm of concentrations of cinchonine in the range of 1×10 10 mol/L to 9×10 8 mol/L. The detection limit for cinchonine was 3.5×10 11mol/L. The sensor was used for the determination of cinchonine in serum samples， with the recoveries of 98.8% to 104.7%.

Keywords Molecular imprinted sensor； Magnetic nanoparticles； Cinchonine； Selfassemble； Electrochemiluminescence

（Received 2 August 2014； accepted 28 October 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21375031， 21165007）endprint