高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定不同畜禽配合飼料中伏馬毒素的含量

郭文博等

摘 要 為摸清復(fù)雜基質(zhì)中FB1和FB2污染的準(zhǔn)確水平，本研究建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS）測(cè)定不同畜禽配合飼料中伏馬毒素B1（FB1）和B2（FB2）的分析方法。樣品用乙腈水（50∶50， V/V）提取，MAX強(qiáng)陰離子固相萃取柱富集凈化后，以0.1%甲酸和甲醇為流動(dòng)相，經(jīng)Thermo C18色譜柱（100 mm×2.1 mm， 5 μm）分離，采用電噴霧正電離（ESI+）多反應(yīng)模式（MRM）監(jiān)測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：不同飼料樣品中FB1和FB2在1～500 μg/kg之間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.9990，定量限分別為0.098和0.197 μg/kg，檢出限分別為0.328和0.656 μg/kg； 低、中、高濃度加標(biāo)回收率為89.7%～95.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.2%～8.6%。用本方法對(duì)市場(chǎng)上采集的106份不同畜禽配合飼料中FB1和FB2含量進(jìn)行測(cè)定，樣品檢出率為98.11%。本方法適用于基質(zhì)復(fù)雜的畜禽配合飼料中伏馬毒素FB1和FB2的準(zhǔn)確、快速定性與定量分析。

關(guān)鍵詞 伏馬毒素； 陰離子固相萃取柱； 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法； 畜禽配合飼料

1 引 言

伏馬毒素是20世紀(jì)80年代末發(fā)現(xiàn)，由串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）在一定溫度和濕度條件下產(chǎn)生的，以污染玉米及其制品為主的水溶性次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，由多氫醇與丙三羧酸組成的雙酯類(lèi)化合物，與人或動(dòng)物機(jī)體內(nèi)神經(jīng)鞘氨醇結(jié)構(gòu)極為相似，在神經(jīng)鞘脂代謝過(guò)程中能競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合神經(jīng)鞘氨醇N2?；D(zhuǎn)移酶，從而抑制神經(jīng)鞘氨醇的生物合成、阻礙鞘脂類(lèi)代謝，引發(fā)各種疾病[2]。研究證實(shí)，伏馬毒素能引起馬大腦白質(zhì)軟化癥（Equine leucoencephalomalacia，ELEM），豬肺水腫綜合征（Porcine pulmonary edema，PPE）； 小鼠實(shí)驗(yàn)也表明， 伏馬毒素對(duì)肝臟或腎臟容易造成損傷[3，4]。此外，伏馬毒素還具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性及免疫毒性，與人類(lèi)食道癌的發(fā)生密切相關(guān)[5]。因此，國(guó)際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）將伏馬毒素列為2B級(jí)致癌物作為人類(lèi)潛在的致癌物質(zhì)。

伏馬毒素主要分布在玉米及玉米制品中，嚴(yán)重威脅畜禽及人類(lèi)健康[6]。玉米作為畜禽配合飼料的最主要原料，是畜牧業(yè)賴以發(fā)展的重要基礎(chǔ)。因此，伏馬毒素含量水平的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)于畜禽配合飼料中伏馬毒素的防控和預(yù)警具有重要意義。目前，關(guān)于飼料中伏馬毒素的檢測(cè)方法主要有柱前衍生高效液相色譜法[7，8]、氣相色譜法[9]、薄層色譜法[10]、酶聯(lián)免疫法[11]等，這些方法前處理復(fù)雜且靈敏度較低，不能滿足快速痕量檢測(cè)的要求。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于玉米及其制品中伏馬毒素的檢測(cè)主要采用高效液相色譜法和熒光光度法[12]，選用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS）作為仲裁法[13]，也有采用LCMS/MS測(cè)定谷物中的伏馬毒素的報(bào)道[14，15]，但這些方法都存在前處理復(fù)雜、靈敏度低等問(wèn)題。此外，畜禽配合飼料由玉米、小麥、麩皮、棉粕、豆粕等多種原料混合而成，基質(zhì)復(fù)雜多樣，容易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，且不同動(dòng)物飼料隨生理性影響組成各有差異，迫切需要一種能適應(yīng)不同配合飼料基質(zhì)、快速有效的檢測(cè)方法，以適應(yīng)飼料行業(yè)監(jiān)督檢查和畜牧業(yè)生產(chǎn)的需求。在前人研究的基礎(chǔ)上，本研究采用MAX陰離子固相萃取柱富集凈化，改進(jìn)流動(dòng)相洗脫程序，縮短分析時(shí)間，有效消除基質(zhì)效應(yīng)，并用LCMS/MS進(jìn)行分析，提高檢測(cè)靈敏度，可用于大批量畜禽配合飼料中FB1和FB2檢測(cè)分析，為不同畜禽配合飼料中伏馬毒素的準(zhǔn)確定量分析提供技術(shù)支撐。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜：TSQ Quant配Surveyor 液相操作系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher scientific公司）； MAX柱（200 mg，6 mL，美國(guó)Waters 公司）。Heraeus Multifuge X3高速離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific中國(guó)有限公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Merck公司）； 甲酸、乙酸（色譜純，美國(guó)Aladdin公司）； FB1、FB2標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)Sigma公司）； 實(shí)驗(yàn)用水由Millopore Synergy超純水儀（美國(guó)Millipore公司）制備。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 液相色譜條件 Thermo C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）； 流動(dòng)相A為0.1%甲酸； 流動(dòng)相B為甲醇； 梯度洗脫： 0～1.0 mim，50% B； 1.0～7.0 min，50%～100% B； 7.0～8.0 min，100% B； 8.0～8.2 min，100%～50% B； 8.2～9.0 min，50% B。流速為300 μL/min； 進(jìn)樣量5 μL； 柱溫30 ℃。

2.2.2 質(zhì)譜條件 范圍m/z 300～800；碎裂電壓為1.5 V； 噴霧電壓為3.5 kV； 霧化氣壓采用電噴霧ESI（+）離子源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）采集；掃描力3500 Pa； 毛細(xì)管溫度為350 ℃； 鞘氣壓45 Pa； 輔助氣壓15 Pa。質(zhì)譜檢測(cè)FB1和FB2的參數(shù)見(jiàn)表1。

2.2.3 樣品提取凈化 將飼料樣品充分粉碎，使其可通過(guò)1 mm孔徑網(wǎng)篩。準(zhǔn)確稱取1.0 g±0.01 g飼料樣品于10 mL離心管中，加入5.0 mL乙腈水（50∶50， V/V）提取劑[16，17]，渦旋混合1 min，超聲1 h，4500 r/min離心10 min。MAX柱依次用5 mL甲醇和5 mL甲醇水（3∶1， V/V）活化，然后加入2 mL上清液，再依次加入5 mL甲醇水（3∶1， V/V）和5 mL甲醇淋洗MAX小柱，最后用10 mL甲醇乙酸（99∶1， V/V）洗脫，收集洗脫液，在45 ℃氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)靡译嫠?0∶50， V/V）定容至1 mL，過(guò)0.22 μm濾膜后待測(cè)。endprint

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

3.1.1 流動(dòng)相組分的選擇

由于伏馬毒素在ESI（+）條件下產(chǎn)生的是[M+H]+離子，而酸性溶液有助于其離子化[18]，所以本實(shí)驗(yàn)選擇在弱洗脫溶液中添加易揮發(fā)的甲酸，提高伏馬毒素離子化效率。本實(shí)驗(yàn)以0.1%甲酸和甲醇為流動(dòng)相，與0.05%， 0.2%， 0.5%甲酸和甲醇相比，兩種伏馬毒素的分離度好，峰形對(duì)稱且靈敏度高，如圖1。因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇0.1%甲酸和甲醇為流動(dòng)相。

3.1.2 起始流動(dòng)相比例的選擇 分別以0.1%甲酸甲醇（80∶20， V/V） 和（50∶50， V/V）作為初始流動(dòng)相，結(jié)果表明：初始流動(dòng)相為0.1%甲酸甲醇（80∶20， V/V）時(shí)，峰形較寬，出峰時(shí)間晚，靈敏度較低； 初始流動(dòng)相為0.1%甲酸甲醇（50∶50， V/V）時(shí)，F(xiàn)B1與的FB2分離度好，出峰時(shí)間適中，峰形對(duì)稱，靈敏度高。因此，選擇0.1%甲酸甲醇（50∶50， V/V）作為梯度洗脫的起始流動(dòng)相。

3.2 不同凈化柱的選擇

3.4 方法的回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取1.00 g粉碎后的飼料樣品，加入適量的FB1和FB2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得飼料基質(zhì)中FB1、FB2的含量分別為50， 100和200 μg/kg，每個(gè)水平做5個(gè)平行，按上述條件進(jìn)行處理和測(cè)定，計(jì)算回收率。FB1、FB2在不同添加水平的回收率見(jiàn)表3，F(xiàn)B1、FB2在飼料基質(zhì)中3個(gè)加標(biāo)水平的回收率為89.7%～95.1%，符合國(guó)際上對(duì)玉米及飼料樣品中伏馬毒素污染殘留檢測(cè)的要求。

3.5 樣品分析

采用方法對(duì)上海及周邊城市隨機(jī)采集的不同品牌7類(lèi)106個(gè)畜禽配合飼料樣品中的FB1、FB2含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3。伏馬毒素檢出率為98.11%，在所有檢測(cè)樣品中，F(xiàn)B1總含量在0～1 mg/kg之間有66個(gè)，占62.26%； 含量在1 mg/kg 以上的有40個(gè)，占37.74%，最高含量達(dá)20.1 mg/kg； FB2含量基本在0～1 mg/kg。因此，本方法適合不同種類(lèi)畜禽配合飼料中FB1、FB2樣品的檢測(cè)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)用乙腈水（50∶50， V/V）作為提取劑，離心后，經(jīng)MAX凈化柱富集凈化，以0.1%甲酸和甲醇為流動(dòng)相分離，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)不同畜禽配合飼料樣品中的FB1和FB2含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，本方法前處理簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、回收率和靈敏度高，適用于畜禽配合飼料中伏馬毒素的準(zhǔn)確定量，為動(dòng)物飼料中伏馬毒素的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

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Abstract A method was developed for the determination of fumonisin B1 （FB1） and fumonisin B2 （FB2） in livestock and poultry formula feeds by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （LCMS/MS. After extracted by acetonitrilewater （50∶50， V/V） and purified with MAX solid phase extraction column， the fumonisins were separated by Thermo C18 （100 mm×2.1 mm， 5 μm） column with 0.1% formic acid in water and methanol as the mobile phase. Multiple reaction monitoring （MRM） was used to acquire mass spectrometric data under electrospray positive ionization mode （ESI+）. The results showed that the linear correlation coefficients （R2） of fumonisin FB1 and FB2 were all greater than 0.999 in the range of 1-500 μg/L. The limits of quantitation （LOQ） were 0.098 and 0.197 μg/L， and the limits of detection （LOD） were 0.328 and 0.656 μg/L， respectively. At different spiked levels， the recoveries of FB1 and FB2 were ranged from 89.7% to 95.1%， and the relative standard deviation （RSD） was ranged from 3.2% to 8.6%. Additionally， the detection rate reached 98.11% screening through the established method in the 106 livestock and poultry formula feeds collected from markets. This result indicates that the method is suitable for accurate quantitative analysis of FB1 and FB2 in different complicated livestock and poultry formula feeds.

Keywords Fumonisins； Anion exchange solid phase extraction column； High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Livestock and poultry formula feeds

（Received 9 September 2014； accepted 5 January 2015）

This work was supported by the Key Project of Developing Agriculture through Science and Technology of Shanghai Municipal Agricultural Commission （No. 38 （2013）， 32 （2014））endprint