顯微注射制備轉(zhuǎn)基因小鼠的優(yōu)化

張譯捷，王智鋒，陳文彬，李 杏，楊珍珍，杜玉濤

(深圳華大方舟生物技術(shù)有限公司，廣東 深圳518083)

動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是一種應(yīng)用于實驗生物學(xué)和應(yīng)用生物學(xué)強(qiáng)有力的工具［1］。這種技術(shù)使得人們在生物體內(nèi)直接研究基因相應(yīng)的功能、調(diào)控作用，以及其在正常狀態(tài)和疾病發(fā)生過程中的作用機(jī)制成為現(xiàn)實［2～4］。轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建的相關(guān)人類疾病的動物模型，使科學(xué)家能夠清楚地認(rèn)識相關(guān)疾病對應(yīng)的遺傳學(xué)和分子機(jī)制，從而能夠開發(fā)出對應(yīng)的疾病治療方案以及設(shè)計出對應(yīng)的藥物靶點［5～8］。

原核顯微注射法是目前應(yīng)用最廣泛的制備轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)，該方法操作較簡單，容易得到完全整合的小鼠，并且得到的轉(zhuǎn)基因動物大多數(shù)可以傳代［9］，但是存在獲得轉(zhuǎn)基因小鼠效率較低的問題。外源DNA 濃度是影響轉(zhuǎn)基因小鼠制備效率的主要因素之一［10］。因此原核顯微注射中，選擇最佳的外源DNA 濃度對科研、生產(chǎn)都非常重要。另外，小鼠品系也是影響轉(zhuǎn)基因效率的因素之一［11］。在Anna B 文章中顯示，采用C57/BL6 小鼠制備轉(zhuǎn)基因小鼠效率較KM 小鼠低［11］。鄭敏等報道，低濃度的外源DNA 注射液有利于提高轉(zhuǎn)基因小鼠的制備效率，但只針對特定的DNA 長度［12］，且采用KM 小鼠為實驗對象，實驗數(shù)據(jù)不足以對C57/BL6小鼠提供參考。本實驗采用C57/BL6 小鼠進(jìn)行實驗優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器與材料

試劑: 孕馬血清促腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺素(hCG) 購于寧波第二激素廠; 透明質(zhì)酸酶、M2、M16 培養(yǎng)基、礦物油均購于Sigmar 公司;酶切產(chǎn)物的純化試劑盒購于Omega 公司。

儀器與主要耗材: 體式顯微鏡、倒置顯微鏡購于Nikon 公司; 顯微注射系統(tǒng)購于Eppendorf 公司;拉針儀、煅針儀分別購于Sutter 公司、Narishige 公司; 原核注射針、持卵針、胚胎移植針均為自制;培養(yǎng)皿及操作盤均購于Becton Dickinson 公司。

1.2 實驗動物

供體鼠為4 ～6 周齡C57/BL6 小鼠; 結(jié)扎公鼠、受體母鼠皆為KM 小鼠，購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.3 實驗方法

1.3.1 外源DNA 的制備

將質(zhì)粒DNA 擴(kuò)增后，酶切線性化，用凝膠回收法純化后融于無菌的TE 緩沖液中，稀釋至相應(yīng)濃度，置于-20 ℃保存等待注射。

1.3.2 供體鼠、結(jié)扎公鼠、受體鼠的制備

動物飼養(yǎng)室的光照時間調(diào)節(jié)為5: 00-19: 00，19: 00 至次日5: 00 為夜晚。

對4 ～6 周齡的C57/BL6 雌性小鼠注射10 IU PMSG，48 h 后注射10 IU hCG，與C57/BL6 雄性小鼠合籠交配，收集有陰道栓的小鼠; 對4 周齡以上的具有生殖功能的KM 雄性小鼠進(jìn)行麻醉，通過外科手術(shù)將其輸精管剪斷，縫合后，靜養(yǎng)4 周，與母鼠合籠制備受體母鼠; 選4 周齡以上的KM 雌性小鼠與結(jié)扎公鼠合籠，次日收集見栓的雌性小鼠，進(jìn)行胚胎移植。

1.3.3 受精卵的收集及處理

對有陰道栓的C57/BL6 雌性小鼠人道處死，剖腹，取卵巢及部分子宮角。取出的組織用M2 清洗，放置在新的M2 溶液中，在體式顯微鏡下，用利器劃開輸卵管，使受精卵從輸卵管中流出。用移液器將帶顆粒細(xì)胞的受精卵轉(zhuǎn)至1 mg/mL 透明質(zhì)酸酶中消化去除顆粒細(xì)胞。在M2 操作液中清洗若干次后，挑選有2 個原核、形態(tài)良好的受精卵，轉(zhuǎn)至M16 培養(yǎng)液放于37 ℃、5% CO2、5% O2、飽和濕度培養(yǎng)箱中待用。

1.3.4 顯微注射

取20 ～30 枚受精卵于注射盤內(nèi)，對較大原核(雄原核) 進(jìn)行注射，見到原核體積明顯增大原來1/3 才算成功注射。若受精卵原核無明顯增大，說明外源DNA 注射液未注入原核中，此類注射為無效注射。注射完畢，將注射后存活的受精卵轉(zhuǎn)至M16 培養(yǎng)液中，放置于37 ℃、5% CO2、5% O2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)30 ～60 min 后移植［13］。

1.3.5 胚胎移植

取同日見栓的受體鼠，麻醉后通過外科手術(shù)在腹部側(cè)位取出卵巢，用鑷子撕破卵巢漿膜，找到輸卵管壺腹部，吸有25 枚左右注射后胚胎的移植針插入其中，將胚胎移植入輸卵管內(nèi)，后將卵巢、輸卵管送回受體鼠體內(nèi)，縫合［13］。

1.3.6 基因型分析

小鼠出生10 d 后，剪小鼠腳趾及鼠尾抽提基因組DNA，進(jìn)行PCR 分析，鑒定轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。

2 結(jié)果

在9 個片段大小不同的實驗組中，相同外源DNA 片段濃度為2.5 ng/μl 實驗組在小鼠懷孕率、出生率、F0 小鼠陽性率上，結(jié)果普遍比5.0 ng/μl實驗組高(見表1)，總效率均高于5.0 ng/μl 實驗組(見圖1)。從圖1 中可看到，外源DNA 長度對制備轉(zhuǎn)基因小鼠效率無線性相關(guān)性，濃度的變化影響轉(zhuǎn)基因小鼠制備的效率。

排除了外源DNA 片段長度對轉(zhuǎn)基因效率的影響，研究外源DNA 濃度變化對轉(zhuǎn)基因效率的影響，2.5 ng/μl 實驗組在小鼠懷孕率(55.2%∶39.8%)、出生率(10.8%∶7.13%)、陽性率(12.4%∶8.53%)、總 效 率(1.17% ∶0.54%) 等結(jié)果均顯著高于5.0 ng/μl實驗組(見表2)。2.5 ng/μl DNA 實驗數(shù)據(jù)在懷孕率、出生率、陽性率、總效率比5.0 ng/μl DNA 注射液結(jié)果顯著提高。

圖1 不同DNA 片段大小的轉(zhuǎn)基因小鼠制備效率

3 討論

目前通過原核注射的方法制備轉(zhuǎn)基因小鼠，仍是廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。顯微注射法可以直接對大分子DNA 片段進(jìn)行操作，容許對轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體進(jìn)行充分優(yōu)化［10］。但影響顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠效率的因素較多［14］，如小鼠品系、DNA 濃度、DNA 片段的狀態(tài)及注射針等，因此對顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行優(yōu)化，仍有重要的意義。

表1 不同大小片段的DNA 顯微注射結(jié)果

表2 兩種濃度的DNA 顯微注射結(jié)果

DNA 的濃度對轉(zhuǎn)基因小鼠的研制效率有較大影響［15］。DNA 濃度過高，小鼠胚胎注射后的存活率較低，從而降低轉(zhuǎn)基因小鼠的制備效率; DNA濃度過低，轉(zhuǎn)基因小鼠的陽性率較低，甚至得不到轉(zhuǎn)基因小鼠［10］。本實驗采用C57/BL6 小鼠為實驗對象，對原核期受精卵注射2.5 ng/μl DNA 溶液，懷孕率、出生率、陽性率、總效率均有顯著的提高。參考Anna B 的分析，C57/BL6 小鼠雖是常用的轉(zhuǎn)基因供體小鼠，但該品系獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠效率較其他品系低［11］，可能原因是DNA 注射液對胚胎而言是外來物，對胚胎有輕微的毒性，C57/BL6小鼠胚胎對外源物質(zhì)更為敏感。對C57/BL6 品系小鼠而言，2.5 ng/μl 的DNA 溶液更適合注射。該結(jié)果與鄭敏等人的結(jié)果一致，但與外源DNA 長度無較大相關(guān)性。

本實驗在對不同大小DNA 片段注射結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠制備效率與DNA 片段大小未呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，結(jié)果與池駿等人的結(jié)果不同［16］。DNA 片段長度并不是影響轉(zhuǎn)基因小鼠制備效率的主要因素，在注射相同片段DNA 的結(jié)果中，濃度是影響轉(zhuǎn)基因小鼠制備效率的主要因素。

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