miR-1284過表達對人胃癌SGC-7901細胞基因表達譜及侵襲轉(zhuǎn)移的影響

韋尉元， 穩(wěn)瓏，詹澤栩，余 晗，謝玉波，肖 強

1. 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科，廣西 南寧530021；

2. 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，廣西 南寧530021

miR-1284過表達對人胃癌SGC-7901細胞基因表達譜及侵襲轉(zhuǎn)移的影響

韋尉元1， 穩(wěn)瓏1，詹澤栩1，余 晗1，謝玉波2，肖 強1

1. 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科，廣西 南寧530021；

2. 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，廣西 南寧530021

背景與目的：人胃癌組織微小RNA表達譜芯片篩選研究報道m(xù)iR-1284與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但其在胃癌中的具體作用鮮見報道。該研究探討miR-1284過表達對人胃癌SGC-7901細胞基因表達譜及侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法：以慢病毒介導(dǎo)miR-1284過表達轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細胞為實驗組(LV-miR-1284組)，轉(zhuǎn)染空載體慢病毒載體的細胞為陰性對照組(LV-NC-GFP組)，未轉(zhuǎn)染慢病毒載體的細胞為空白組(Control組)。采用熒光定量PCR檢測各組細胞miR-1284的表達，芯片檢測各組細胞差異表達基因，生物信息學(xué)預(yù)測miR-1284的靶基因，Transwell侵襲實驗檢測各組細胞侵襲能力，裸鼠皮下移植瘤模型檢測各組細胞轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果：PCR結(jié)果顯示，與LV-NC-GFP組和Control組比較，LV-miR-1284組細胞miR-1284表達明顯增高；芯片結(jié)果顯示，LV-miR-1284組有20個基因表達顯著上調(diào)，17個基因表達顯著下調(diào)；生物信息學(xué)預(yù)測miR-1284的靶基因有138個基因；Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，LV-miR-1284組侵襲細胞數(shù)為70.00±2.37，其細胞侵襲能力較LV-NCGFP組(168.67±4.55)和Control組(170.33±3.08)明顯減弱；體內(nèi)裸鼠實驗結(jié)果顯示，LV-miR-1284組肝臟轉(zhuǎn)移率為14.29%，其細胞轉(zhuǎn)移能力較LV-NC-GFP組(85.71%)和Control組(85.71%)明顯減弱。結(jié)論：miR-1284過表達能抑制人胃癌SGC-7901細胞侵襲轉(zhuǎn)移，其機制可能與調(diào)控SUMO1、JUN基因表達有關(guān)。

胃癌；miR-1284；侵襲；轉(zhuǎn)移

胃癌是發(fā)生率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的主要因素。因此，深入探討胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移機制，尋找胃癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子，對胃癌的治療及預(yù)后具有重要的意義。微小RNA(microRNA，miRNA)發(fā)揮作用主要在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控蛋白編碼基因，且與胃癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1-2］。最近，胃癌miRNA表達譜芯片篩選研究報道了miR-1284在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組織比原胃癌組織表達量少［3］，提示其表達異?？赡芘c胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移相關(guān)。而miR-1284在胃癌中的具體作用及機制鮮見報道，因此，本研究擬探討miR-1284對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料及試劑

人胃癌細胞株SGC-7901購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所細胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel購自美國BD公司；miR-1284過表達慢病毒載體和質(zhì)粒由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建合成；芯片檢測由北京華聯(lián)生物科技有限公司完成；miRNA反轉(zhuǎn)錄、定量PCR試劑盒、引物購自寶生物工程(大連)有限公司；21只4～5周齡雌性BALB/c裸鼠，體質(zhì)量18～22 g，SPF級，購自廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

SGC-7901細胞使用RPMI-1640(含10%胎牛血清)培養(yǎng)液，在CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，常規(guī)胰酶消化細胞用于轉(zhuǎn)染實驗，以4×105個細胞/孔的密度接種于6 孔板，細胞長到50%～60%時，每孔更換為900 μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中加入100 μL LipofectamineTM2000，實驗組(LV-miR-1284組)和陰性對照組(LV-NCGFP組)每孔分別加入含miR-1284的病毒載體(5×108TU/mL)6.4 μL及陰性對照病毒(8× 108TU/mL)4 μL，轉(zhuǎn)染24 h后，更換為RPMI-1640(含10%胎牛血清)培養(yǎng)液，72 h后用含5 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)液篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株用于后續(xù)實驗。

1.3 總RNA 提取及質(zhì)檢

取LV-miR-1284組、LV-NC-GFP組、空白組(control組，未轉(zhuǎn)染病毒的SGC-7901細胞)的細胞，用PBS洗滌，按照TRIzol試劑說明提取總RNA。采用紫外分光光度計分別測定波長230、260和280 nm的吸光度(D)值，確定樣品總RNA的純度和濃度。以安捷倫RNA 6000 nano assay檢測RIN評估RNA樣本中18 s與28 s(真核生物)是否完整，以判定RNA的完整性(RIN值在0～10之間，以10 分為滿分，RIN ＞ 6表示樣本的完整性良好可用于實驗)。

1.4 熒光實時定量PCR 檢測miR-1284的表達

采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37 ℃，60 min。以合成的cDNA作為模板，U6作為內(nèi)參，U6上游引物序列為5’-TTATGGGTCCTAGCCTGAC-3’，下游引物序列為5’-CACTATTGCGGGTCTGC-3’；miR-1284上游引物序列為5’-UCUAUACAG ACCCUGGCUUUUC-3’，下游引物序列為5’-CGTCTATACAGACCCTGGCTTTTC-3’。以SYBR Premix Ex TaqⅡ為擴增染料，進一步進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，1個循環(huán)；PCR反應(yīng)95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算miR-1284的相對表達量。

1.5 全基因表達譜芯片檢測表達差異基因

以UniGene 最新數(shù)據(jù)庫為篩選差異表達基因芯片基礎(chǔ)。取LV-miR-1284組和LV-NC-GFP組的總RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄、標記，芯片雜交前須先進行前雜交處理，最后雜交、洗染，用激光共聚焦掃描儀對雜交結(jié)束后的芯片進行掃描，對雜交信號值進行扣本底、標準化，顯著差異表達1.3倍以上的基因作為篩選納入標準。

1.6 生物信息學(xué)分析芯片結(jié)果及預(yù)測miR-1284的靶基因

采用KEGG和GO進行通路及功能富集分析。用MiRanda、TargetScan和microRNA軟件預(yù)測miR-1284的靶基因，網(wǎng)站分別為http://www. miranda.com、http://www.targetscan.org、http:// www.microrna.org。取芯片表達差異基因和生物信息學(xué)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因的交集作為miR-1284的靶基因。

1.7 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力

取Corning小室(孔徑8 μm)，在小室濾膜上鋪一層Matrigel(用無血清培養(yǎng)液1∶4稀釋，75 μL/孔，37 ℃溫育30 min，形成膠狀)，在上室孔中加入未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染后篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞(4×105個/孔，無血清培養(yǎng)基的單細胞懸液)。每組設(shè)4個復(fù)孔。下室中加入含10%血清的培養(yǎng)液600 μL，培養(yǎng)24 h后用冰預(yù)冷的甲醇固定30 min，用0.1%結(jié)晶紫染色15～20 min，用PBS洗3遍以上，顯微鏡100倍下拍照。隨機選取10個視野進行細胞計數(shù)，計算平均每個視野侵襲細胞數(shù)。

1.8 裸鼠皮下移植瘤模型檢測細胞轉(zhuǎn)移能力

對LV-miR-1284組、LV-NC-GFP組、空白組的細胞，用PBS制備密度為2×107個/mL的單細胞懸液；取4～5周齡的裸鼠21只，每組7只，選取所有裸鼠左前肢腋窩作為種植部位，緩慢進針至皮下推注各組細胞0.25 mL(1×107個細胞)/只，正常喂養(yǎng)，監(jiān)測裸鼠的生命及腫瘤生長情況；注射細胞后第38天脫頸椎法處死裸鼠，完整切取腫瘤組織和肝、肺組織。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。各組實驗數(shù)據(jù)均用表示，各組間差異采用單因素方差分析，進一步組內(nèi)比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 樣本總RNA質(zhì)量鑒定結(jié)果

從LV-miR-1284組、LV-NC-GFP組和空白組細胞中提取總RNA，用紫外分光光度計測量D值。結(jié)果表明，D260/D280=1.95，D260、D230＞1.72，提示提取總RNA 純度高，蛋白質(zhì)和DNA污染少。樣本進一步以安捷倫RNA 6000 nano assay檢測證實，RIN＞6表示樣本的完整性良好，可用于后續(xù)實驗(表1)。

2.2 miR-1284在各組細胞中的表達情況

熒光定量PCR檢測結(jié)果用2-△△Ct值表示，與LV-NC-GFP組(3.20±1.00)和空白組(1.00±0.00)比較，miR-1284的表達量在LV- miR-1284組(52.30±2.40)顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；LV-NC-GFP組和空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 miR-1284過表達慢病毒轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞后差異表達的基因分析

對LV-miR-1284組和LV-NC-GFP組細胞中UniGene數(shù)據(jù)庫人類基因表達譜數(shù)據(jù)進行分析表明，在檢測到31 741個基因中，143個基因為差異性表達，其中顯著表達上調(diào)20個，顯著表達下調(diào)17個(表2)。

表 1 RNA質(zhì)檢結(jié)果Tab. 1 The results of RNA quality inspection

表 2 miR-1284過表達慢病毒轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞顯著差異表達的基因Tab. 2 Significantly differential expression of genes in SGC-7901 cells infected with lentivirus containing over-expression of miR-1284

2.4 生物信息學(xué)分析芯片結(jié)果及預(yù)測miR-1284的靶基因

采用KEGG和GO進行通路及功能富集分析。結(jié)果顯示，LV-miR-1284組中的顯著差異表達基因TAOK2、NTF4、MAP3K13、JUN、GADD45A、DUSP1、DUSP4、DDIT3與MAPK信號通路相關(guān)，且JUN與腫瘤惡性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(圖1)。生物信息學(xué)網(wǎng)站軟件預(yù)測miR-1284的靶基因為138個(表3)。取芯片表達差異基因和生物信息學(xué)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因的交集，EIF4A1、KLF10、C8orf4、SUMO1基因為miR-1284的預(yù)測靶基因。

2.5 miR-1284對胃癌SGC-7901細胞侵襲能力的作用

Transwell侵襲實驗結(jié)果提示，上調(diào)胃癌細胞miR-1284表達后，24 h時LV-miR-1284組侵襲細胞數(shù)為70.00±2.40，LV-NC-GFP組為168.70±4.60，空白組為170.30±3.10。與LVNC-GFP組和空白組比較，LV-miR-1284組侵襲細胞數(shù)均明顯較少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

圖 1 JUN基因參與MAPK信號通路調(diào)控Fig. 1 JUN gene involved in MAPK signaling pathway

圖 2 各組胃癌SGC-7901細胞的侵襲情況Fig. 2 Invasive situation of gastric cancer SGC-7901 cells in each group

2.6 裸鼠皮下移植瘤模型的細胞轉(zhuǎn)移能力

肝肺組織病理檢查顯示：LV-miR-1284組肝臟轉(zhuǎn)移率為14.29%，LV-NC-GFP組為85.71%，空白組為85.71%；LV-miR-1284組肺臟轉(zhuǎn)移率為0.00%，LV-NC-GFP組為57.14%，空白組為42.86%。與LV-NC-GFP組和空白組比較，LV-miR-1284組細胞肝臟轉(zhuǎn)移率明顯較少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；LV-miR-1284組細胞肺臟轉(zhuǎn)移率均較少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖3，表4)。

表 3 生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測miR-1284的靶基因Tab. 3 The target genes of miR-1284 predicted by bioinformatics website

圖 3 各組肝肺組織的裸鼠移植瘤細胞Fig. 3 HE staining of liver and lung tissues in cells transplanted tumor of nude mice in each group

表 4 各組細胞裸鼠移植瘤肝肺轉(zhuǎn)移情況Tab. 4 The metastasis cases of liver and lung tissues in cells transplanted tumor of nude mice in each group

3 討 論

近年來，已證實微小miRNA是一類長約19～25個核普酸序列的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，成熟的miRNA通過和靶基因mRNA堿基配對部分互補或完全互補結(jié)合，抑制其翻譯或?qū)е缕浣到舛鸬皆谵D(zhuǎn)錄后水平沉默基因表達的作用， miRNA的表達異常參與了細胞的多種生物學(xué)過程，比如細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等［4］。最近胃癌miRNA表達譜芯片篩選研究報道了miR-1284在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組織比原胃癌組織表達量少［3］。而胃癌是常見的惡性腫瘤，且影響胃癌預(yù)后的主要因素就是胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移情況［5］。因此，研究與胃癌侵襲及轉(zhuǎn)移可能密切相關(guān)的miR-1284具有重要意義。

本研究通過構(gòu)建miR-1284過表達慢病毒載體，轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細胞，體外實驗發(fā)現(xiàn)細胞侵襲能力下降，動物體內(nèi)模型也顯示能明顯降低胃癌肝臟轉(zhuǎn)移能力，且細胞芯片結(jié)果分析提示miR-1284與MAPK信號通路相關(guān)，且能顯著降低JUN的表達，而JUN與腫瘤血管形成及惡性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6］。我們生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)SUMO1基因為miR-1284的預(yù)測靶基因，SUMO1蛋白的表達與癌組織的浸潤深度和遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)［7］，且SUMO1能調(diào)控JUN的表達［8］，而在腫瘤中JUN表達降低可下調(diào)MMP蛋白的表達。MMP蛋白的活性降低，改變腫瘤細胞的侵襲能力，腫瘤細胞侵犯血管能力下降，進而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移［9］。

綜上所述，miR-1284過表達抑制胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移，可能與其靶向調(diào)控SUMO1基因有關(guān)，進而調(diào)控JUN基因信號通路，從而抑制胃癌的發(fā)生、發(fā)展，提示miR-1284可作為研究胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要靶點；而miR-1284是否直接調(diào)控SUMO1基因，將有待實驗進一步驗證。

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The effect of miR-1284 over-expression on gene expression profiling and invasion/metastasis of human gastric cancer SGC-7901 cells

WEI Weiyuan1, CAO Wenlong1, ZHAN Zexu1, YU Han1, XIE Yubo2, XIAO Qiang1

(1. Department of Gastrointestine and Gland Surgery, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi, China; 2. Department of Anesthesiology, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi, China)

XIAO Qiang E-mail: xiaoqiang20050@aliyun.com

Background and purpose: It has been reported that miR-1284 is associated with gastric cancer lymph node metastasis in the research of microRNA microarray in human gastric cancer tissues. But the specific role of miR-1284 in gastric cancer has not been reported. The aim of this study was to investigate the effect of miR-1284 over-expression on the gene expression profiling and invasion/metastasis of human gastric cancer SGC-7901 cells. Methods: Gastric cancer SGC-7901 cells of LV-miR-1284 group were transfected with lentiviral vectors of miR-1284, cells of LV-NC-GFP group were transfected with lentiviral vectors without miR-1284, and cells of control group were not transfected with lentiviral vectors. The expression of miR-1284 was detected by the real-time fluorescent quantitative PCR. Differential expression genes were detected by the microRNA chip. Target genes of miR-1284 were predicted by the bioinformatics. Invasive ability was detected by the Transwell invasion assay. Metastasis ability was detected by subcutaneously transplanted tumor model of nude mice. Results: Compared with LV-NC-GFP and control groups, the expressions of miR-1284 and 20 genes were up-regulated, and the expression of 17 genes was down-regulated in LV-miR-1284 group. One hundred and thirty-eight target genes of miR-1284 were predicted by the bioinformatics website. Compared with invasive cell number of LV-NC-GFP group (168.67±4.55) and control group (170.33±3.08), the ability of invasion ofcells was weakened in LV-miR-1284 group (70.00±2.37). Compared with the liver metastasis rate of LV-NC-GFP group (85.71%) and control group (85.71%), the ability of metastasis of cells was weakened in LV-miR-1284 group (14.29%). Conclusion: The ability of invasion and metastasis of SGC-7901 cells is suppressed by over-expression of miR-1284. The mechanism may be related to regulating the expression of SUMO1 and JUN genes.

Gastric carcinoma; miR-1284; Invasion; Metastasis

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.09.003

R73-37；R735.2

A

1007-3639(2015)09-0659-06

2015-03-24

2015-05-08）

廣西科學(xué)技術(shù)攻關(guān)項目(桂科攻14124004-1-9)；2015年廣西研究生教育創(chuàng)新計劃項目(YCBZ2015028)。

肖強 E-mail:xiaoqiang20050@aliyun.com