食品中肉類成分的法醫(yī)學(xué)種屬鑒別方法

辛彩蕊

一、形態(tài)學(xué)方法①參見(jiàn)Cattaneo C,DiMartino S,Scali S,Craig O E,Grandi M,Sokol R J.Determining the human origin of fragments of burnt bone: a comparative study of histological, immunological and DNA techniques, Forensic Science International, 1999, 1022-3;Folin M,Contiero E.Electrophoretic analysis of non-human primates hair keratin, Forensic science international, 1996,83:191-199; Kazuhiko Imaizumi,Kei Saitoh,Kazumasa Sekiguchi,Mineo Yoshino.Identification of fragmented bones based on anthropological and DNA analyses: case report, Legal Medicine, 2002, 4:251-256; Owsley D W,Mires A M,Keith M S.Case involving differentiation of deer and human bone fragments, Journal of Forensic Sciences, 1985, 30（2）:572-578.

形態(tài)學(xué)方法是法醫(yī)學(xué)中最早應(yīng)用于種屬鑒定的方法，主要根據(jù)大體和顯微鏡下的形態(tài)、結(jié)構(gòu)差異對(duì)檢材的種屬予以鑒別，如根據(jù)肉質(zhì)的鮮嫩程度、肌肉纖維的粗細(xì)、顯微鏡下紅細(xì)胞的形態(tài)差異來(lái)進(jìn)行鑒別。運(yùn)用此方法進(jìn)行種屬鑒別，檢材范圍受限，以骨骼、毛發(fā)多見(jiàn)；對(duì)于血液樣本往往只能區(qū)分鳥(niǎo)類和人類，且鑒定結(jié)論受鑒定人主觀因素影響較大；而對(duì)于微量、腐敗、加工過(guò)的食品則無(wú)法進(jìn)行有效、準(zhǔn)確的種屬鑒別，因此在公安實(shí)踐中運(yùn)用有一定的局限性。

二、血清學(xué)方法②參見(jiàn)Takashi Kitao, Satoru Miyaishi, Hideo Ishizu.Identification of human skeletal muscle from a tissue fragment by detection of human myoglobin using a double-sandwich ELISA, Forensic Science International, 1995, 71: 205-214; Takashi Kitao,Satoru Miyaishi,Yuji Yamamoto, Hideo Ishizu.Identification of human skin from a tissue fragment by detection of squamous cell carcinoma-related antigen using an enzyme immunoassay, Forensic Science International, 1996,83:81-86.

血清學(xué)方法和形態(tài)學(xué)方法都是經(jīng)典的種屬鑒別方法，血清學(xué)具體方法主要有：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、纖維蛋白溶解實(shí)驗(yàn)、等點(diǎn)聚焦等。近年來(lái)ELISA 法在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用大多集中在對(duì)微生物的檢測(cè)。當(dāng)下在美國(guó)通過(guò)FDA 認(rèn)證的、用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米的EnviroLogix ELISA 試劑盒就是以ELISA 法為核心技術(shù)的研發(fā)產(chǎn)品。由于血清學(xué)方法主要通過(guò)檢測(cè)檢材中的種屬特異性蛋白來(lái)區(qū)分，因此對(duì)檢材的要求較高，對(duì)于經(jīng)過(guò)腌制、高溫烘烤、蒸煮加熱加工或是污染、降解的肉類食品鑒定起來(lái)有一定難度，加之其可檢測(cè)時(shí)限短，對(duì)法醫(yī)學(xué)的部分檢材往往不能成功進(jìn)行種屬鑒別。

三、DNA分析法

與蛋白質(zhì)相比較而言，DNA 分子具有諸多優(yōu)點(diǎn)：相對(duì)穩(wěn)定，特異性好，靈敏度高，對(duì)于微量的檢材也能成功進(jìn)行分析、鑒別。因此，DNA分析法成為了近年來(lái)我國(guó)公安機(jī)關(guān)進(jìn)行肉類食品種屬鑒別的研究熱點(diǎn)和核心方法。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，核DNA 和線粒體DNA 都是食品中肉類成分種屬鑒別的目的基因。由于線粒體DNA 比核DNA 的集聚突變速度快10 倍，更容易區(qū)分不同的物種，因此在種屬鑒別領(lǐng)域具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。目前，線粒體DNA 已成為了種屬鑒別的研究重點(diǎn)和核心。

DNA 的高溫?zé)岱€(wěn)定性、存在于所有組織和不隨基因編碼變化的特點(diǎn)使其在檢測(cè)方面勝過(guò)蛋白質(zhì)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，尤其是聚合酶鏈反應(yīng) （Polymerase chain reaction， PCR）技術(shù)的出現(xiàn)和廣泛使用，為我們以核酸檢測(cè)為基礎(chǔ)進(jìn)行食品中肉類成分的種屬鑒別提供了有效的手段?？v觀肉類食品種屬鑒別的DNA 分析方法，基本上大部分都是以PCR 技術(shù)為核心，并在該技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的衍生技術(shù)。

（一）PCR技術(shù)

1985年問(wèn)世的PCR 技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域具有劃時(shí)代意義，使人們對(duì)于微量檢材的體外無(wú)限擴(kuò)增核酸片段的愿望成為了現(xiàn)實(shí)。PCR 是一種用于體外放大擴(kuò)增特定的DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，多次重復(fù)循環(huán)，在短時(shí)間內(nèi)使目的基因片段成指數(shù)級(jí)倍數(shù)增長(zhǎng)。顯而易見(jiàn)，PCR 最大特點(diǎn)就是能使微量的DNA 大幅增加，以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)微量檢材的DNA 分析。以PCR 為核心的肉制品種屬鑒別技術(shù)的原理是：根據(jù)肉類食品的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR 技術(shù)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因片段的指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，然后通過(guò)電泳或是熒光檢測(cè)技術(shù)對(duì)食品中肉類成分的種屬進(jìn)行鑒別。

（二）PCR-RFLP技術(shù)

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragment length polymorphism，縮寫 RFLP）作為第一代DNA 分子標(biāo)記技術(shù)，利用限制性內(nèi)切酶能識(shí)別并切割基因序列，并在特定序列處消化切割DNA 分子，從而產(chǎn)生限制性片段的特性。PCR-RFLP 技術(shù)，就是首先對(duì)目的基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，再經(jīng)特異性限制性內(nèi)切酶酶切，產(chǎn)生特異性的DNA 片段。然后再根據(jù)DNA 上已知的酶切位點(diǎn)和預(yù)期的酶切結(jié)果，與DNA分子量DNA Marker 對(duì)比，判斷酶切是否成功。由于檢材的種屬來(lái)源不同，導(dǎo)致各種動(dòng)物的酶切位點(diǎn)不同，因此酶切片段的數(shù)量和長(zhǎng)度不相同，可根據(jù)此差別來(lái)對(duì)肉制品的種屬進(jìn)行鑒別。Girish①Girish P S.Anjaneyulu A S R,Viswas,et al.Meat species identification by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) of mitochondrial 12SrRNA gene, Meat Science.2005,70:107-112.等學(xué)者分別運(yùn)用四種限制性內(nèi)切酶AluⅠ、HhaⅠ、ApoⅠ和BspTⅠ對(duì)山羊、綿羊、牛、水牛的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并根據(jù)其酶切片段的差異鑒別出 4 種不同動(dòng)物的種屬來(lái)源。Wolf②Wolf C,Rentsch J,Hübner P.PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: a reliable method for species identification,Journal of agricultural and food chemistry,1999,47（4）:1350-355.等使用三種限制性內(nèi)切酶AluⅠ、RsaⅠ、HinⅡ?qū)σ柏i、梅花鹿、等25 種野生動(dòng)物進(jìn)行酶切，結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使是親緣關(guān)系較近的物種也可以被成功地鑒別出來(lái)。

（三）電泳

電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶點(diǎn)性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。常用的凝膠電泳有兩大類，即瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。在肉制品的種屬鑒定中，常常對(duì)目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物或是酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，再根據(jù)電泳譜帶對(duì)檢材進(jìn)行種屬鑒別。林子清①林子清等：《采用PCR-RFLP 技術(shù)鑒別肉類食品種屬》，《中國(guó)法醫(yī)學(xué)會(huì)、公安部物證鑒定中心.全國(guó)第九次法醫(yī)學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集》2013年。等人應(yīng)用PCR-RFLP 和聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染色的方法，擴(kuò)增牛、羊、馬、驢、豬、狗、貓、鴨、雞共計(jì)9種常見(jiàn)食品的動(dòng)物肉類線粒體DNA 細(xì)胞色素b 基因的DNA 片段，并用限制性內(nèi)切酶stu-I 和Ssp-I 消化后經(jīng)電泳分離，結(jié)果顯示上述9 種被檢動(dòng)物的DNA 譜帶均不相同，完全能夠準(zhǔn)確地區(qū)分出每種動(dòng)物。M.Ali Muhammed②M.Ali Muhammed,B.Sri Charan Bindu,R.Jini,K.V.Harish Prashanth,N.Bhaskar.Evaluation of different DNA extraction methods for the detection of adulteration in raw and processed meat through polymerase chain reaction—restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP), Journal of Food Science and Technology,2015,521.等人運(yùn)用PCR-RFLP 方法對(duì)脊椎動(dòng)物的肉制品進(jìn)行種屬鑒別，測(cè)試結(jié)果表明使用這種方法，即使約1%摻假的情況下對(duì)摻假的生肉和熟肉制品加工的混合物依舊可以成功檢測(cè)肉類成分。

（四）DNA測(cè)序技術(shù)

基因測(cè)序是一種強(qiáng)有力的種屬鑒別工具。當(dāng)檢材的動(dòng)物來(lái)源及其特性完全未知時(shí)，通常先使用已知的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后將產(chǎn)物測(cè)序后與 GenBank 中的有關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而確定動(dòng)物物種。Parson W③ParsonW, PegoraroK,NiederstatterH, et a.l Species identification bymeans of the cytochrome B gene.International Journal of LegalMedicine, 2000, 114: 23-28.等對(duì)44 種不同種類（魚(yú)類、哺乳類、鳥(niǎo)類、爬行類、兩棲類）的動(dòng)物CytB 基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并對(duì) CytB 基因片段進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)基因序列的比對(duì)分析，從而成功區(qū)分個(gè)樣品的種屬來(lái)源。Bhawna Dubey④Bhawna Dubey,P.R.Meganathan,Ikramul Haque.DNA mini-barcoding: An approach for forensic identification of some endangered Indian snake species.Forensic Science International: Genetics,2010,53:.等人利用DNA 的微型條形碼對(duì)一些瀕危的印度蛇種進(jìn)行了研究,表明了該方法在蛇物種鑒定中的有效性。但是，基因測(cè)序的開(kāi)展需要高度專業(yè)的設(shè)備和試劑，操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，還必須由技術(shù)熟練的專業(yè)人員完成，因此在公安實(shí)際工作中受到了一定的限制。

綜上所述，目前食品中肉類成分種屬鑒別方法的研究主要集中在DNA 分析層面，今后隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人類或許能夠探索、研發(fā)出可以在現(xiàn)場(chǎng)快速進(jìn)行種屬鑒別的更可靠方法。