同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯

李 杰，于瑞祥，許卓妮，李永利，陳 鷹，王 虎

(上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院，上海 201203)

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同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯

李 杰，于瑞祥，許卓妮，李永利，陳 鷹，王 虎

(上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院，上海 201203)

建立了同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定酸奶、奶酪等發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯(EC)含量的方法，通過優(yōu)化前處理方法，考察了提取溶劑的種類、提取次數(shù)對(duì)樣品提取效果的影響。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，使用氨基甲酸乙酯-d5作為內(nèi)標(biāo)定量。結(jié)果表明：在0.05～20.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 8，檢出限為0.02 mg/L；在3個(gè)加標(biāo)水平下，樣品的回收率在98.9%～102.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～4.8%。該方法前處理簡單、提取效果好，具有比外標(biāo)定量法更好的靈敏度和可靠性，適用于發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯含量的監(jiān)控。

氨基甲酸乙酯(EC)；發(fā)酵乳；同位素稀釋；氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)又稱尿烷，是發(fā)酵食品(如面包、酸牛奶、乳酪、醬油及酒類飲料等)在發(fā)酵和儲(chǔ)存過程中產(chǎn)生的一種化學(xué)污染物。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將氨基甲酸乙酯列入確認(rèn)的人類可能致癌物質(zhì)(2A類)，許多國家也針對(duì)其制定了限量標(biāo)準(zhǔn)。我國目前只有出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)推薦了進(jìn)出口酒中EC的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[1]，但沒有相關(guān)的限量法規(guī)，對(duì)EC的監(jiān)管仍停留在基礎(chǔ)方法研究和食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控方面。

目前，對(duì)EC的檢測(cè)方法主要有液相色譜-熒光檢測(cè)法[2-4]、氣相色譜法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜法[6-12]、液相色譜-質(zhì)譜法[13]，目標(biāo)樣品多集中于酒類、醬油等產(chǎn)品，而對(duì)發(fā)酵乳中EC的研究較少。雖然發(fā)酵乳中EC含量比酒類樣品中的低，但作為常見的發(fā)酵產(chǎn)品，在日常生活中接觸很多，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，因此有必要對(duì)其進(jìn)行監(jiān)控。

本工作主要針對(duì)常見的發(fā)酵乳進(jìn)行EC含量檢測(cè)方法的研究，通過對(duì)樣品前處理進(jìn)行優(yōu)化，采用同位素稀釋質(zhì)譜(IDMS)與氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)結(jié)合的方法，希望獲得較低的檢出限和較好的回收率，以達(dá)到對(duì)發(fā)酵乳中EC進(jìn)行有效檢測(cè)和篩查的目的。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

6890-5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有電子轟擊源(EI)；R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水器：美國Millipore公司產(chǎn)品；離心機(jī)：美國Sigma公司產(chǎn)品；MS1渦旋混合器：德國IKA公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

乙腈、甲醇、正己烷(色譜純)：美國Honeywell公司產(chǎn)品；乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、乙醚(分析純)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；無水硫酸鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，于500 ℃烘4 h 以上，冷卻后儲(chǔ)存于干燥器中，備用。

氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)：德國Dr. Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；氨基甲酸乙酯-d5(EC-d5，純度≥99.5%，豐度≥99.0%)：上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：HP-Innowax毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.5 μm)；升溫程序：60 ℃保持1 min，以7.5 ℃/min升至180 ℃，再以30 ℃/min升至240 ℃，保持3 min；載氣(He)流速1.0 mL/min，壓力57 kPa，進(jìn)樣量2.0 μL；不分流進(jìn)樣。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；選擇性離子監(jiān)測(cè)模式(SIM)；氨基甲酸乙酯定性離子m/z62、74、89，定量離子m/z62；氨基甲酸乙酯-d5定性離子m/z44、64、76，定量離子m/z64；溶劑延遲6 min。

1.4 樣品前處理

酸奶：準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品于15 mL離心管中，加入100 μL濃度為10 mg/L的EC-d5溶液，再加入5 mL乙酸乙酯，渦旋混勻2 min，以4 500 r/min離心5 min，取上層有機(jī)相于梨形瓶中，在下層試樣中加入5 mL乙酸乙酯，按上述步驟重復(fù)提取1次，合并上層有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。準(zhǔn)確加入1 mL乙腈，溶解殘?jiān)?，加入少量無水硫酸鈉，混勻。將殘?jiān)D(zhuǎn)移到離心管中，離心，取乙腈層，待測(cè)。

乳酪：準(zhǔn)確稱取1.00 g樣品于15 mL離心管中，加入5 mL水超聲溶解，再加入100 μL濃度為10 mg/L EC-d5溶液混勻，提取步驟同酸奶。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

由于發(fā)酵乳的成分復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)明顯，需要采用相應(yīng)的前處理技術(shù)進(jìn)行凈化。目前，檢測(cè)發(fā)酵類食品中EC常采用硅藻土凈化的前處理方法[14]，該方法不僅處理時(shí)間長，而且要消耗大量的試劑。本實(shí)驗(yàn)嘗試采用溶劑直接萃取的方法，以達(dá)到快速、高效的目的。

實(shí)驗(yàn)考察了乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醚等不同溶劑對(duì)發(fā)酵乳中EC的提取效果，具體的提取步驟參見1.4節(jié)。結(jié)果表明，5種提取溶劑與發(fā)酵乳均有較好的分層效果，但由于離心后二氯甲烷提取層在底部，獲取提取液困難，且易引入誤差，不利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。外標(biāo)定量法測(cè)定不同溶劑提取回收率實(shí)驗(yàn)表明：加標(biāo)濃度為1.0 μg/g時(shí)，乙腈和甲醇只有約50%的回收率；乙醚的回收率略好，為55%；乙酸乙酯的回收率可達(dá)80%，具有較高的提取效率。因此，選擇乙酸乙酯作為提取溶劑，并分別考察了提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提取2次與3次獲得的回收率結(jié)果相近，因此采用2次提取，以節(jié)省溶劑和操作時(shí)間。

2.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

由于食品類樣品具有基質(zhì)復(fù)雜、待測(cè)物提取困難、干擾多等特點(diǎn)，因此，待測(cè)物很難從樣品中完全提取，采用外標(biāo)法定量偏差較大，而內(nèi)標(biāo)法能夠?qū)悠分写郎y(cè)物含量進(jìn)行有效校正，可以提供更好的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性。有文獻(xiàn)報(bào)道采用氨基甲酸丁酯作為內(nèi)標(biāo)物檢測(cè)發(fā)酵食品中EC含量[7,12]，此內(nèi)標(biāo)物具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn)。但是鑒于氨基甲酸丁酯與EC 在結(jié)構(gòu)和極性方面存在的差異，在基質(zhì)、提取液中的分配系數(shù)和提取效果也不盡相同，因此作為檢測(cè)內(nèi)標(biāo)時(shí)回收率并不理想。同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)與待測(cè)物具有幾乎一致的提取回收率、色譜保留特性、溶解性等其他理化性質(zhì)，

能夠有效地校正樣品前處理過程中造成的偏差，是最理想的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，相應(yīng)的同位素稀釋質(zhì)譜法也是目前復(fù)雜基質(zhì)樣品中痕量有機(jī)物檢測(cè)較為準(zhǔn)確可靠的方法。因此，本實(shí)驗(yàn)采用EC-d5作為檢測(cè)內(nèi)標(biāo)物。

2.3 色譜及質(zhì)譜條件的確定

由于EC含有的氨基具有較高的極性，因此選擇極性INNOWAX色譜柱進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用該柱對(duì)EC進(jìn)行分析時(shí)，雜質(zhì)干擾少、峰形對(duì)稱、靈敏度高。取EC標(biāo)準(zhǔn)品和EC-d5內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣，獲得的全掃描質(zhì)譜圖示于圖1。選擇靈敏度高且選擇性好的m/z62、m/z64碎片離子分別作為氨基甲酸乙酯及其同位素內(nèi)標(biāo)物的定量離子，同時(shí)選擇m/z44、 62、89碎片離子作為EC的定性離子，m/z44、64、76碎片離子作為EC-d5的定性離子。

根據(jù)EC質(zhì)譜圖嘗試解析了其可能的裂解途徑和機(jī)理，示于圖2。氮帶正電荷的自由基離子會(huì)發(fā)生α斷裂生成m/z44碎片離子，或經(jīng)過氫自由基遷移、逆Diels-Alder重排后生成m/z62碎片離子；氧帶正電荷的自由基離子會(huì)發(fā)生α斷裂或α均裂，分別生成m/z74、45碎片離子。因氧元素的電負(fù)性強(qiáng)于氮元素，氮正離子較氧正離子的穩(wěn)定性更好，所以m/z89、62碎片離子的強(qiáng)度和高于m/z74、45碎片離子的強(qiáng)度和；由于m/z62碎片離子可以通過N-C-O的共軛系統(tǒng)穩(wěn)定正離子，所以具有最高的強(qiáng)度。通過以上裂解途徑推測(cè)出的EC-d5裂解情況與實(shí)際得到的EC-d5質(zhì)譜圖完全相符，驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)所推測(cè)的裂解機(jī)理。

圖1 氨基甲酸乙酯(a)及其同位素內(nèi)標(biāo)氨基甲酸乙酯-d5(b)的質(zhì)譜圖Fig.1 MS spectrum of EC(a) and EC-d5(b)

圖2 氨基甲酸乙酯可能的裂解途徑Fig.2 The proposed fragmentation pathway of ethyl carbamate

2.4 線性范圍、檢出限

按照本實(shí)驗(yàn)條件，分別配制含1.0 mg/L EC-d5內(nèi)標(biāo)的0.05、0.2、1.0、5.0、20.0 mg/L系列EC標(biāo)準(zhǔn)溶液，用內(nèi)標(biāo)定量法測(cè)定。以分析物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值(y)對(duì)分析物的質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸，獲得的線性方程為y=1.135 9x+0.034 4，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 8。結(jié)果表明，在0.05～20 mg/L范圍內(nèi)，EC和EC-d5定量離子的響應(yīng)峰面積比值與EC的質(zhì)量濃度有很好的線性關(guān)系。以3倍信噪比(S/N)計(jì)算EC的檢出限為0.02 mg/L。

2.5 檢測(cè)方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的估算

在不確定度的主要影響分量中，內(nèi)標(biāo)溶液濃度的不確定度主要由內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的純度和豐度不確定度、稱量不確定度、定容不確定度組成，所以該分量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.6 回收率與精密度

在不含EC的發(fā)酵乳樣品中按照前述方法進(jìn)行添加回收和精密度實(shí)驗(yàn)。在0.1、1.0、10.0 mg/L 3個(gè)加標(biāo)水平下，每個(gè)水平做6次平行實(shí)驗(yàn)，得到的結(jié)果列于表1。由表1可見，同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)定量法檢測(cè)EC的回收率在98.9%～102.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5%(n=6)。結(jié)果表明，本方法具有很好的準(zhǔn)確度和精密度，與使用外標(biāo)定量法回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(約80%)相比，可以明顯的體現(xiàn)出同位素稀釋質(zhì)譜法在復(fù)雜基質(zhì)樣品中痕量物質(zhì)檢測(cè)時(shí)前處理簡單高效、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的優(yōu)勢(shì)。

2.7 實(shí)際樣品分析

按照實(shí)驗(yàn)建立的方法，分別對(duì)老酸奶、酸奶和乳酪3種不同的實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果列于表2。結(jié)果表明，部分樣品中檢測(cè)出極少量的EC，說明發(fā)酵乳產(chǎn)品中存在含有EC的風(fēng)險(xiǎn)，鑒于國家尚未出臺(tái)相應(yīng)的檢測(cè)限量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)發(fā)酵乳制品中EC含量的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控非常必要。

表1 加標(biāo)樣品的回收率和精密度(n=6)

表2 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

注：nd為未檢出

3 結(jié)論

采用同位素稀釋結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法對(duì)發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯含量進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，此方法前處理簡單、試劑消耗量少、檢測(cè)靈敏度高、精密度好、回收完全，能有效地進(jìn)行發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯含量的檢測(cè)。另外，本研究使用自制的氨基甲酸乙酯-d5穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)，與進(jìn)口穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)試劑相比，分析成本大大降低，有利于我國擺脫對(duì)國外進(jìn)口試劑的依賴，在一定程度上，對(duì)填補(bǔ)我國穩(wěn)定性同位素化合物制備及其產(chǎn)業(yè)化方面的空白具有十分重要的意義。

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Determination of Ethyl Carbamate in Fermented Dairy Products by Isotope Dilution-GC/MS

LI Jie, YU Rui-xiang, XU Zhuo-ni, LI Yong-li, CHEN Ying, WANG Hu

(ShanghaiInstituteofMeasurementandTestingTechnology,Shanghai201203,China)

A method for determination of ethyl carbamate in fermented dairy products was proposed by gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) with deuterium ethyl carbamate as isotopic internal standard. The types and times of extraction solvents were discussed to establish efficient pretreatment method. The results show that the calibration curve has good linearity in the range of 0.05-20 mg/L with the correlation coefficient of 0.999 8, and the limit of detection is 0.02 mg/L. The recoveries range from 98.9% to 102.9% with RSDs of 0.6%-4.8% in three levels. The method is simple, rapid, accurate, and can be applied in the quantification of ethyl carbamate in fermented dairy products.

ethyl carbamate (EC); fermented dairy products; isotope dilution; gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS)

2014-05-30;

2014-09-17

上海市科委科研計(jì)劃項(xiàng)目 (12142201000)資助

李 杰(1983—)，男(漢族)，甘肅蘭州人，博士，從事色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制。E-mail: lijie@simt.com.cn

時(shí)間：2015-01-30；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20150130.1526.007.html

O657.63

A

1004-2997(2015)03-0268-06

10.7538/zpxb.youxian.2015.0006