液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析大鼠血液中基因組DNA羥甲基化水平

陳光照，楊柳青，文 娟，葛苗苗，張立堅(jiān)，蔡 春

(1.廣東醫(yī)學(xué)院分析中心，廣東 湛江 524023；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041)

?

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析大鼠血液中基因組DNA羥甲基化水平

陳光照1，楊柳青2，文 娟1，葛苗苗1，張立堅(jiān)1，蔡 春1

(1.廣東醫(yī)學(xué)院分析中心，廣東 湛江 524023；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041)

5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)是由TET蛋白家族催化氧化5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)生成的，對(duì)哺乳動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本研究建立了血液樣品中5hmC的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定方法，采用試劑盒法提取血液基因組DNA，在甲酸環(huán)境下加熱裂解，采用HILIC色譜柱分離，電噴霧電離和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式定量。結(jié)果表明：5hmC在0.1～50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 4；高、中、低3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為95.87%，日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.42%和4.12%；5hmC的檢出限(LOD，S/N=3)為0.050 μg/L，定量限(LOQ，S/N=10)為0.100 μg/L。該方法準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定、靈敏，可用于血液樣品全基因組中5-羥甲基胞嘧啶的檢測(cè)分析。

5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)；DNA羥甲基化；血液；大鼠

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)介導(dǎo)下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)為甲基供體，將1個(gè)甲基共價(jià)結(jié)合到胞嘧啶環(huán)(Cyt)第5位碳原子上，成為5-甲基胞嘧啶(5mC)，5mC在TET(ten-eleven translocation)蛋白加雙氧酶家族催化氧化下生成5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)[1]。在哺乳動(dòng)物基因組內(nèi)，DNA甲基化修飾在胚胎發(fā)育、基因表達(dá)調(diào)控、X染色體失活、腫瘤與遺傳病等方面發(fā)揮著重要的作用。近年來，隨著TET蛋白家族功能的發(fā)現(xiàn)，DNA羥甲基化在表觀遺傳領(lǐng)域越來越受到重視。Jin等[2]指出5hmC存在于人類大腦額葉組織；Robertson等[3]在人類胚胎干細(xì)胞調(diào)控基因的啟動(dòng)子上檢測(cè)到5hmC；Jin等[4]指出DNA中5hmC可以抑制參與5mC轉(zhuǎn)錄調(diào)控的甲基化結(jié)合蛋白，從而導(dǎo)致DNA被動(dòng)去甲基化，這說明5hmC在表觀遺傳中充當(dāng)著重要的角色。

與基因組DNA甲基化檢測(cè)方法不同，絕大多數(shù)方法，如限制性內(nèi)切酶處理和重亞硫酸鹽測(cè)序都不能區(qū)分5mC 和5hmC[4-5]。由于5hmC在體內(nèi)的含量較低，定量檢測(cè)基因組DNA中的5hmC在技術(shù)上具有一定的挑戰(zhàn)性。5hmC現(xiàn)有的檢測(cè)方法有：薄層色譜法[6]、液相色譜法[6-7]、免疫組織化學(xué)法[8]、糖基化法和在糖基化基礎(chǔ)上的化學(xué)標(biāo)記法[9-10]；另外，通過單分子實(shí)時(shí)測(cè)序法[9]和應(yīng)用氧化重硫酸鹽測(cè)序法也能對(duì)5hmc進(jìn)行定量測(cè)定[11-12]，但是，這些分析方法均存在半定量或效率不高的局限。近年來，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)在表觀遺傳領(lǐng)域的發(fā)展較快，陳麗宇、張立堅(jiān)等[13-15]采用LC-MS/MS法檢測(cè)了組織中的5hmC含量，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確性高、檢測(cè)限低等特點(diǎn)，但尚未發(fā)現(xiàn)血液中5hmC的LC/MS分析報(bào)道。

本研究采用試劑盒法提取血液中全基因組DNA，并用甲酸加熱水解，親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定DNA水解堿基Cyt、5mC與5hmC的含量，并分析SD大鼠血液中DNA羥甲基化水平，以期為血液樣品中5hmC定量測(cè)定提供方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；Agilent 1200-6430A液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品。

胞嘧啶(Cytosine,Cyt)、5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)、5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosing,5hmC)標(biāo)準(zhǔn)品：德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；同位素胞嘧啶(Cytosine-13C15N2,Cyt13C15N2)： Toronto research chemicals Inc公司產(chǎn)品；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司等4家公司產(chǎn)品；乙腈、甲酸(色譜純)：德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；甲酸銨(色譜純)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；無水乙醇為分析純；實(shí)驗(yàn)用水：由美國(guó)Millipore公司超純水器制備。

1.2 血液樣品DNA提取和處理

1.2.1 血液樣品DNA提取 抽取16周齡SPF級(jí)的SD大鼠心臟血液于血常規(guī)試管中，以3 000 r/min離心5 min，取3～4 mL下層血液，按照試劑盒的說明步驟提取血液全基因組DNA。

1.2.2 DNA的水解及處理 取約1 μg DNA和200 μL 50 μg/L的Cyt13C15N2于反應(yīng)瓶中，用N2吹干，加入200 μL 88%甲酸，于140 ℃下反應(yīng)90 min，冷卻至室溫后用N2吹干，再加入200 μL乙腈-7 mmol/L甲酸銨水溶液(93∶7，V/V)溶解，以15 000 r/min離心5 min，取上清液，供LC-MS/MS分析。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取一定量的Cyt、5mC和5hmC固體標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容，配制成1 mg/L的Cyt、5mC及5hmC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取一定量的Cyt13C15N2內(nèi)標(biāo)物，用甲醇溶解并定容，配制成1 mg/L的Cyt13C15N2內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。所有儲(chǔ)備液在4 ℃下避光保存，使用時(shí)用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件 BEH HILIC色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7m)；流動(dòng)相：A為7 mmol/L 甲酸銨，B為乙腈；流速0.3 mL/min，柱溫20 ℃，進(jìn)樣量5 μL；梯度洗脫程序：0—1.5 min，93%B；1.5—3.7 min，93%B降至50%B；3.7—8.7 min，維持50%B；8.7 min，升至93%B；8.7—15 min，93%B維持7 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI)，正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)定量；5hmc的母離子m/z142.0，定量離子m/z124.0，定性離子m/z81.0；干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速10 L/min；毛細(xì)管電壓4 000 V。Cyt、5mC分析條件參見文獻(xiàn)[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 血液DNA提取及水解條件優(yōu)化

DNA提取的質(zhì)量對(duì)后續(xù)的質(zhì)譜定量分析有著重要的影響。為探討不同試劑盒提取血液DNA對(duì)后續(xù)分析的差異，比較了4家公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒的提取效果，并設(shè)置空白對(duì)照組。用紫外光度法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，4種試劑盒提取的DNA純度均較好，A260/A280值均在1.7～1.9之間。但在瓊脂糖凝膠電泳圖上可見：c和d兩個(gè)廠家生產(chǎn)的試劑盒提取的DNA降解明顯，拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重；a和b兩個(gè)廠家生產(chǎn)的試劑盒提取效果則較好，DNA較完整、條帶明亮，示于圖1。綜合DNA提取效果、操作簡(jiǎn)便程度和試劑盒成本等因素，本實(shí)驗(yàn)選擇了天根公司的基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行血液樣品基因組DNA的提取。

注： a.天根公司試劑盒；b.QIAGEN公司試劑盒； c.某生物公司的小量抽提試劑盒； d.某生物公司的磁珠法試劑盒(血液)；M. DNA標(biāo)記圖1 不同公司試劑盒提取的DNA電泳結(jié)果Fig.1 DNA electrophoresis results of different corporations’ kit

在DNA裂解環(huán)節(jié)，通過設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照實(shí)驗(yàn)和空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)考察樣品的水解是否對(duì)LC-MS/MS靈敏度和分離度產(chǎn)生干擾。采用DNA提取試液加標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，采用DNA提取試液作空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。LC-MS/MS分析結(jié)果顯示：與標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖比較，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照色譜峰的靈敏度和分離度均較好；空白對(duì)照顯示基線沒有干擾峰，說明水解過程對(duì)LC-MS/MS分析沒有影響。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為提高目標(biāo)化合物的響應(yīng)，對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。分別加入5 μL 1 mg/L的5hmC、Cyt、5mC和Cyt13C15N2標(biāo)準(zhǔn)溶液，在正、負(fù)離子模式下，m/z50～500范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描，以選擇合適的準(zhǔn)分子離子峰和電離方式。5hmC、Cyt、5mC和Cyt13C15N2在正離子模式下的響應(yīng)較高，示于圖2。在選擇離子監(jiān)測(cè)模式下，優(yōu)化了5hmC、Cyt、5mC和Cyt13C15N2的錐孔電壓值，使其響應(yīng)達(dá)到最高；并在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下對(duì)5hmC、Cyt、5mC和Cyt13C15N2的定量和定性離子的碰撞能量進(jìn)行了優(yōu)化，最終選用m/z142.0/124.0、112.0/95.0、126.0/109.0、115.0/97.0分別作為5hmC、Cyt、5mC和Cyt13C15N2的定量離子對(duì)；選用m/z142.0/81.0、112.0/69.0、126.0/83.0、115.0/70.0分別作為對(duì)應(yīng)的輔助定性離子對(duì)[16]。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 色譜柱的選擇 Cyt、5mC和5hmC都是

極性較強(qiáng)的化合物，在反相色譜柱中幾乎沒有保留，因而無法分離。HILIC色譜柱對(duì)極性樣品有很好的保留和分離能力，能滿足極性較強(qiáng)的樣品分析。此外，由于HILIC流動(dòng)相含有高濃度的有機(jī)溶劑，有利于增強(qiáng)電噴霧質(zhì)譜的離子化效率，從而提高分析靈敏度，與質(zhì)譜具有很好的兼容性，為此，選擇HILIC色譜柱分離這3個(gè)組分。

2.3.2 流動(dòng)相的優(yōu)化 為了優(yōu)化Cyt、5mC和5hmC在HILIC色譜柱中的保留和分離條件，探討了乙睛和水相的比例、甲酸銨溶液濃度及流動(dòng)相流速對(duì)樣品分離及靈敏度的影響。

在固定流速下，乙腈的比例升高，5hmC的峰面積增加，但峰寬增大；然而，水相的比例升高，色譜峰的峰寬變小，但響應(yīng)降低，出峰時(shí)間縮短，目標(biāo)組分易受干擾。綜合考慮上述因素，采用1.4.1節(jié)中的梯度洗脫程序進(jìn)行洗脫。

圖2 5hmC、Cyt、5mC和Cyt13C15N2的全掃描(a, c, e, g)和子離子優(yōu)化(b, d, f, h)圖Fig.2 Full-scan(a, c, e, g) and product ion optimization(b, d, f, h) spectrogram of 5hmC, Cyt, 5mC and Cyt13C15N2, respectively

在已優(yōu)化的梯度洗脫條件下，分別配制2.5、5、7、10、15 mmol/L甲酸銨溶液的水相，考察5hmC的靈敏度和峰面積，發(fā)現(xiàn)甲酸銨濃度為7 mmol/L時(shí)，5hmC的峰形、靈敏度、分離度及重現(xiàn)性較好。同時(shí)優(yōu)化了流動(dòng)相流速，結(jié)果表明，采用7 mmol/L甲酸銨水溶液和乙腈作為流動(dòng)相，以0.3 mL/min流速進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，Cyt、5mC和5hmC的分離度和靈敏度均較好，且這3個(gè)組分也沒有相互干擾，色譜圖示于圖3。

2.4 線性范圍、檢出限及定量限

分別配制0.1、0.5、1、5、10、15、30 μg/L的5hmC標(biāo)準(zhǔn)溶液，各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)Cyt13C15N2的質(zhì)量濃度均為50 μg/L，在優(yōu)化條件下進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)中DNA樣品含有一定量的5hmC，故采用標(biāo)準(zhǔn)溶液法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以5hmC的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到Cyt、5mC和5hmC的回歸方程列于表1。Cyt、5mC和5hmC的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以信噪比大于3確定樣品的檢出限(LOD)，以信噪比大于10確定樣品的定量限(LOQ)，結(jié)果列于表1。

2.5 重復(fù)性和精密度實(shí)驗(yàn)

取同一DNA樣品在同一天的2、4、6、8、10 h及第1、2、3、4、5 d進(jìn)行重復(fù)測(cè)試；取10 μg/L 5hmC標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明，5hmC測(cè)定值的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.42%和4.12%，精密度RSD為3.79%，說明方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好。

2.6 方法的回收率

為考察分析方法的準(zhǔn)確性，在裂解瓶中分別加入200 μL 25、5和1 μg/L的5hmC標(biāo)準(zhǔn)溶液，用N2吹干，按1.2.2節(jié)DNA的水解及處理方法操作，結(jié)果列于表2。在不同的加標(biāo)濃度下，Cyt、5mC和5hmC的回收率均在92%～103%之間，RSD小于7%，可見該方法的準(zhǔn)確性較高。

圖3 化合物Cyt, Cyt13C15N2, 5mC, 5hmC的分離色譜圖Fig.3 Chromatographic separation of Cyt, Cyt13C15N2, 5mC and 5hmC

2.7 血液樣品分析

平行抽取16周齡SPF級(jí)的SD大鼠血液，按照1.2節(jié)的方法提取和處理樣品，采用LC-MS/MS檢測(cè)，并分別通過2.4節(jié)的線性方程得出DNA中Cyt、5mC和5hmC的摩爾濃度M。通過公式T=Mshmc/[MCyt+M5mC+M5hmC]×100%計(jì)算DNA羥甲基化程度。結(jié)果表明，SD大鼠血液基因組DNA中羥甲基化水平為0.48%(RSD=3.42%,n=10)，表明本方法適用于血液基因組DNA羥甲基化水平的分析。

表1 Cyt、5mC和5hmC的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

表2 5hmC加標(biāo)回收率及精密度(n=6)

3 結(jié)論

本研究建立了LC-MS/MS方法分析血液全基因組中的5hmC，該方法可在3 h內(nèi)完成SD大鼠血液中5hmC全過程的分析。結(jié)果表明，DNA的甲酸水解方法較酶解法更節(jié)約樣品處理時(shí)間，HILIC柱適合保留和分離Cyt、5mC和5hmC，該方法具有快速、靈敏、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于血液中5hmC的分析檢測(cè)。

[1] TAHILIANI M, KOH K P, SHEN Y, et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1[J]. Science, 2009, 324(5 929): 930-935.

[2] JIN S G, WU X, LI A X, et al. Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain[J]. Nucleic Acids Res, 2011, 39(12): 5 015-5 024.

[3] ROBERTSON A B, DAHL J A, VAGBO C B, et al. A novel method for the efficient and selective identification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA[J]. Nucleic Acids Res, 2011, 39(8): e55.

[4] JIN S G, KADAM S,PFEIFER G P. Examination of the specificity of DNA methylation profiling techniques towards 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine[J]. Nucleic Acids Res, 2010, 38(11): e125.

[5] NESTOR C, RUZOV A, MEEHAN R, et al. Enzymatic approaches and bisulfite sequencing cannot distinguish between 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in DNA[J]. Biotechniques, 2010, 48(4): 317-319.

[6] KRIAUCIONIS S, HEINTZ N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain[J]. Science, 2009, 324(5 929): 929-930.

[7] KIZAKI S,SUGIYAMA H. CGmCGCG is a versatile substrate with which to evaluate Tet protein activity[J]. Org Biomol Chem, 2014, 12(1): 104-107.

[8] ALMEIDA R D, SOTTILE V, LOOSE M, et al. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals[J]. Epigenetics, 2012, 7(2): 137-140.

[9] SONG C X, CLARK T A, LU X Y, et al. Sensitive and specific single-molecule sequencing of 5-hydroxymethylcytosine[J]. Nat Methods, 2012, 9(1): 75-77.

[10]TERRAGNI J, BITINAITE J, ZHENG Y, et al. Biochemical characterization of recombinant beta-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes[J]. Biochemistry, 2012, 51(5): 1 009-1 019.

[11]BOOTH M J, BRANCO M R, FICZ G, et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution[J]. Science, 2012, 336(6 083): 934-937.

[12]WEN L, LI X, YAN L, et al. Whole-genome analysis of 5-hydroxymethylcytosine and 5-methylcytosine at base resolution in the human brain[J]. Genome Biol, 2014, 15(3): R49.

[13]陳麗宇,張立堅(jiān),張良滔,等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析組織中基因組脫氧核糖核酸羥甲基胞嘧啶水平[J]. 色譜,2012,30(5):533-537.

CHEN Liyu, ZHANG Lijian, ZHANG Liangtao, et al. Analysis of global deoxyribonucleic acid 5-hydroxymethylcytosine in tissue by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2012, 30(5): 533-537.

[14]ZHANG L, ZHANG L, ZHOU K, et al. Simultaneous determination of global DNA methylation and hydroxymethylation levels by hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Biomol Screen, 2012, 17(7): 877-884.

[15]ZHANG L T, ZHANG L J, ZHANG J J, et al. Quantification of the sixth DNA base 5-hydroxymethylcytosine in colorectal cancer tissue and C-26 cell line[J]. Bioanalysis, 2013, 5(7): 839-845.

[16]ZHANG J J, ZHANG L, ZHOU K, et al. Analysis of global DNA methylation by hydrophilic interaction ultra high-pressure liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Anal Biochem, 2011, 413(2): 164-170.

Analysis of Global DNA Hydroxymethylation in Rats’ Blood by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHEN Guang-zhao1, YANG Liu-qing2, WEN Juan1, GE Miao-miao1,ZHANG Li-jian1, CAI Chun1

(1.AnalysisCenterofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524023,China;2.WestChinaSchoolofPharmacy,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), which was formed from the enzymatic oxidation of 5-methylcytosine (5mC) by TET proteins family, played an important role in gene transcription and expression regulation as a new epigenetic modified in mammal animal. A method for global DNA hydroxymethylation in blood sample of rats using hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) was developed. Genomic DNA from blood samples was extracted by genomic DNA isolation kit, and then was hydrolyzed with formic acid at 140 ℃. The LC separation was conducted on Waters HILIC column by gradient elution with acetonitrile-7 mmol/L ammonium formate as mobile phase, and the analysis were performed by tandem MS with positive ion electrospray ionization (ESI+) in multiple reaction monitoring (MRM) mode. The results show that the calibration curve with a good linearity in the concentration range of 0.1-50 μg/L is established for 5hmC, and the correlation coefficients are higher than 0.999. The limit of detection (LOD, S/N=3) and the limit of quantification (LOQ，S/N=10) for 5hmC are 0.050 and 0.100 μg/L, respectively. The relative standard deviations (RSD) of the intra-day and inter-day precision are 3.42% and 4.12%, respectively. The recovery of the spiked standards varies from 92.51% to 102.19%. The method is applied to analyze the hydroxymethylation level of genomic DNA from the blood samples of rats, and a average 5hmC degree of 0.48% is acquired. The method is available for the determination of global DNA hydroxymethylation in blood for its simplicity, speediness, and precision.

5-hydroxymethylcytosing(5hmC); liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS); DNA hydroxymethylation; blood; rat

2014-07-08;

2014-08-25

國(guó)家自然科學(xué)基金(21375029)；廣東省學(xué)科建設(shè)基金(2013CXZDA018)資助

陳光照(1990—)，男(漢族)，廣東湛江人，碩士研究生，生物醫(yī)學(xué)分析專業(yè)。E-mail: 849405005@qq.com

蔡 春(1961—)，男(漢族)，廣東湛江人，教授，從事生物醫(yī)學(xué)分析研究。E-mail: caichun@gdmc.edu.cn

時(shí)間：2015-01-30；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20150130.1551.011.html

O657.63

A

1004-2997(2015)03-0249-06

10.7538/zpxb.youxian.2015.0011