假單胞菌SJTD-1全蛋白質(zhì)組學研究

孫文兵，侯敬麗

(1.上海交通大學生命科學技術(shù)學院，上海 200240；2.上海交通大學分析測試中心，上海 200240)

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假單胞菌SJTD-1全蛋白質(zhì)組學研究

孫文兵1，侯敬麗2

(1.上海交通大學生命科學技術(shù)學院，上海 200240；2.上海交通大學分析測試中心，上海 200240)

近年來，石油泄漏對海洋和土壤的污染事件頻發(fā)，解決這一污染問題非常重要。本實驗從原油污染的土壤中分離得到一株新的銅綠假單胞菌株SJTD-1，使用SDS-PAGE-1DLC-MS和offline-2DLC-MS兩種方法研究其全蛋白質(zhì)組。利用這兩種技術(shù)平臺分別鑒定獲得1 453個和1 623個可信蛋白，共鑒定到1 912個可信蛋白。通過比較兩種技術(shù)路線所鑒定到蛋白種類的差異，發(fā)現(xiàn)offline-2DLC-MS有利于SJTD-1菌株的膜蛋白、相對分子質(zhì)量較大的蛋白和pI值不大于8的蛋白的鑒定。另外，對所有鑒定到的可信蛋白進行GO功能注釋，亞細胞定位分析和代謝通路富集分析。通過對分離獲得的SJTD-1菌株進行蛋白質(zhì)組學分析，可為銅綠假單胞菌SJTD-1分解環(huán)烷烴以及SJTD-1在生物修復(fù)應(yīng)用中的研究奠定基礎(chǔ)。

銅綠假單胞菌；蛋白質(zhì)組學；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；離線二維色譜

石油的開采、煉制、貯運和使用過程會對海洋和土壤造成極大的污染。一些石油烴類經(jīng)過食物鏈進入動物體內(nèi)后，對哺乳類動物及人類有致癌、致畸、致突變的作用，嚴重危害人類健康。目前，國際上通用的石油污染治理及回收方法可大致分為物理法、化學法和生物法。生物法依賴微生物對石油的降解作用[1-2]，具有迅速、無殘毒、成本低等優(yōu)點，當當前研究的熱點[3]。能降解石油烴的微生物很多[4]，但對于大多數(shù)微生物來說，十六個碳以上的烷烴不易降解[5]。本課題組分離得到一個可以降解長鏈環(huán)烷烴的銅綠假單胞菌SJTD-1，已經(jīng)測定了SJTD-1菌株的全基因組序列[6]，并推測SJTD-1菌株包含5 647個CDS序列，其中95%的CDS都與銅綠假單胞菌PAO1基因組相同[7]。雖然SJTD-1全基因組草圖已經(jīng)發(fā)布，但是SJTD-1的蛋白質(zhì)組還沒有被研究。

本實驗利用SDS-PAGE-1DLC-MS和offline-2DLC-MS串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定SJTD-1菌株的全蛋白質(zhì)組，并分析兩種技術(shù)路線鑒定的蛋白種類差異及其優(yōu)缺點，研究SJTD-1菌株的全蛋白質(zhì)組圖譜，以期為銅綠假單胞菌SJTD-1分解環(huán)烷烴以及SJTD-1在生物修復(fù)中的研究奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和數(shù)據(jù)分析軟件

Dionex ultimate 3000納升液相色譜儀，Thermo Surveyor高效液相色譜儀：美國Themo-Fisher公司產(chǎn)品；Maxis impact UHR四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀：德國Bruker公司產(chǎn)品，配有納升電噴霧離子源；Mascot軟件：英國Matrix Science公司產(chǎn)品；數(shù)據(jù)質(zhì)控軟件Scaffold_4.0.5：美國Proteome Software公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

實驗菌株銅綠假單胞菌SJTD-1：由本實驗室分離得到，在環(huán)十八烷烴中生長良好；二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)、碳酸氫銨、甲酸銨等：美國Sigma公司產(chǎn)品；測序用胰酶：美國Promega公司產(chǎn)品；10 K超濾管：德國Sartorius公司產(chǎn)品；乙腈、乙醇、異丙醇(色譜純)：德國Merk公司產(chǎn)品；其他常用試劑：上海生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌培養(yǎng) 將銅綠假單胞菌SJTD-1菌株接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，生長至OD600約1.2后離心收集。

1.3.2 全蛋白的提取 離心收集細胞，加入3 mL細胞裂解液(40 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，8 mol/L尿素，4% CHAPS，65 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF,1 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L EGTA)，混合振蕩1 min，懸浮于冰面上，超聲破碎10 min(超聲功率300 W，超聲3 s，停3 s)。將細胞裂解液于4 ℃，以20 000 g/min離心15 min去除細胞碎片。提取的上清液用5倍體積混合液(乙醇∶丙酮∶乙酸=50∶50∶0.1,V/V/V)過夜沉淀，以25 000 g/min于4 ℃離心1 h，收集沉淀。沉淀干燥后用還原溶液(6 mol/L鹽酸胍，50 mmol/L碳酸氫銨)重溶，Bradford法測定蛋白濃度，剩余樣品于-20 ℃保存，備用。

1.3.3 膠內(nèi)酶解 取60～80 μg蛋白做10% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍進行膠染色，脫色后，用干凈刀片將膠條等分切割成10份，向每份中加入DTT至終濃度為20 mmol/L，60 ℃水浴還原1 h；再加入IAM至終濃度為25 mmol/L，避光反應(yīng)30 min后，依次用50 mmol/L碳酸氫銨，100%乙腈洗滌，最后加入10 mg/L胰酶過夜酶解；次日用100%乙腈萃取；沉淀干燥后，用上樣緩沖液(水∶乙腈∶甲酸=97.9∶2∶0.1，V/V/V)溶解，待測。

1.3.4 FASP酶解[8]取一定量蛋白加入DTT至終濃度為20 mmol/L，于56 ℃ 溫育1 h還原蛋白；再加入IAM至終濃度為90 mmol/L，進行烷基化反應(yīng)，將蛋白溶液轉(zhuǎn)入10 K超濾管中，離心棄掉收集管底部溶液；加入50 mmol/L碳酸氫銨離心20 min，棄掉收集管底部溶液，重復(fù)操作3次；按質(zhì)量比1∶50加入胰蛋白酶，過夜酶解；次日，離心收集酶解消化后的肽段溶液，并干燥保存。

1.3.5 高效液相色譜儀(HPLC)分級收集 酶解后的多肽混合物利用HPLC對多肽進行分級收集。多肽分離色譜柱為Durashell-C18分析柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)。流動相A為20 mmol/L甲酸銨(pH 10)，流動相B為20 mmol/L甲酸銨和80%乙腈混合液(pH 10)。酶解后的多肽混合物用30 μL 20 mmol/L甲酸銨(pH 10)溶解。HPLC分級收集條件：流速0.8 mL/min；分離梯度0～5 min、5%B，16～30 min、5%～15% B，31～45 min、15%～38%B，46～54.5 min、90%B，55～65 min、5%B。從第10 min開始，依次收集洗脫液，干燥后根據(jù)HPLC紫外監(jiān)測情況，將得到的組分用上樣緩沖液(水∶乙腈∶甲酸=97.9∶2∶0.1，V/V/V)溶解，并合并成10個組分。

1.4 實驗條件

1.4.1 色譜條件 液相分離分析柱為C18反相分析柱(75 μm×15 cm×3 μm)；多肽富集柱為C18反相柱(100 μm×2 cm×5 μm)；流動相A為甲酸水溶液(0.1∶99.9，V/V)，流動相B為甲酸-乙腈溶液(0.1∶99.9，V/V)；流速為400 nL/min；多肽洗脫梯度：0～87 min、2～30%B，88～98 min、30%～50%B，99～109 min、50～80%B，110～120 min、80%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 ESI+模式，質(zhì)譜電噴霧毛細管電壓1 900 V，氣體流速2.0 L/min，離子源溫度120 ℃，選擇母離子m/z350～1 500進行二級碎裂。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 Mascot搜庫 使用Data Analysis 4.1軟件提取離子峰生成mgf文件。Mascot 4.0搜索引擎搜索Nr_Pseudomonas aeruginosa PA01_201312蛋白數(shù)據(jù)庫(37 636條目)；母離子質(zhì)量容差2×10-5，二級譜圖質(zhì)量容差0.050 u，固定修飾為C+57，可變修飾為M+16，胰酶最大漏切位點數(shù)為1。利用數(shù)據(jù)質(zhì)控軟件Scaffold_4.0.5做搜庫文件數(shù)據(jù)分析，多肽置信度設(shè)置為1%FDR，一個蛋白至少檢出2個唯一肽段。

1.5.2 生物信息學分析 利用生物信息學網(wǎng)站(http:∥www.pantherdb.org/)對搜索到的蛋白進行GO分子功能注釋分析；利用生物信息學網(wǎng)站(http:∥db.psort.org/)對蛋白進行亞細胞定位分析；利用生物信息學網(wǎng)站(http:∥david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)對蛋白進行代謝通路的富集；另外利用在線蛋白分析網(wǎng)站(http:∥www.expasy.com)對兩組蛋白質(zhì)等電點和相對分子質(zhì)量進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 SJTD-1的生長曲線

每2 h測定一次OD600，其生長曲線示于圖1。結(jié)果顯示，接種8 h后，細菌生長進入對數(shù)期，并且能夠延續(xù)30 h。因此，選擇培養(yǎng)15 h后的細胞進行收集能滿足實驗需求。

圖1 SJTD-1在LB培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curve of SJTD-1 cultured in LB medium

2.2 兩種技術(shù)路線分析SJTD-1蛋白質(zhì)組

兩種技術(shù)路線示意圖示于圖2。

圖2 兩種方法技術(shù)路線示意圖Fig.2 Schematic diagram of the two different techniques

利用SDS-PAGE-1DLC-MS和offline-2DLC-MS技術(shù)方法分別對SJTD-1菌株進行了蛋白質(zhì)組分析，并進行了2次生物學重復(fù)實驗，分別鑒定到1 453個和1 623個可信蛋白，共鑒定到1 912個可信蛋白，示于圖3。

圖3 SDS-PAGE-1DLC-MS和offline-2DLC-MS方法鑒定蛋白數(shù)目差異Fig.3 The difference between SDS-PAGE-1DLC-MS and offline-2DLC-MS for proteome identification

在PSORTb3.00數(shù)據(jù)庫中分析顯示，SJTD-1質(zhì)膜蛋白和外膜蛋白分別占總蛋白的22.9%和3.1%。對SDS-PAGE-1DLC-MS和offline-2DLC-MS技術(shù)方法鑒定到的蛋白進行膜定位分析，比較結(jié)果示于圖4。由圖4可見，SDS-PAGE-1DLC-MS方法鑒定到的膜蛋白數(shù)目明顯少于offline-2DLC-MS方法。與高豐度的可溶性蛋白相比，膜蛋白的相對分子質(zhì)量大，豐度較低，而且在二維凝膠電泳過程中容易聚集，整合膜蛋白很難酶解[9]。因此，近年來研究者廣泛采用SDS-PAGE-1DLC-MS和多維色譜蛋白質(zhì)組學技術(shù)共同研究膜蛋白[10-11]。offline-2DLC-MS技術(shù)采用FASP 方法酶解提取全蛋白，F(xiàn)ASP方法能夠有效地酶解膜蛋白，從而提高膜蛋白的鑒定效率[12]。前人研究表明，近26%的人類基因編碼為膜蛋白[13]，因此在人類膜蛋白的鑒定研究中，offline-2DLC-MS技術(shù)可提供借鑒。

圖4 兩種技術(shù)方法對SJTD-1膜蛋白鑒定數(shù)目比較Fig.4 Comparison of membrane proteins of SJTD-1 identified by two techniques

圖5 SJTD-1總蛋白相對分子質(zhì)量分布Fig.5 Relative molecular weight distribution of identified proteins of SJTD-1

對鑒定蛋白的相對分子質(zhì)量分布進行分析，結(jié)果示于圖5。由圖5可見，offline-2DLC-MS方法鑒定到的大于30 ku的蛋白數(shù)量明顯高于SDS-PAGE-1DLC-MS方法，可見offline-2DLC-MS方法在檢測相對分子質(zhì)量高于30 ku的蛋白中有明顯優(yōu)勢，更有利于相對分子質(zhì)量較大蛋白的檢測。

圖6 SJTD-1總蛋白等電點分布Fig.6 Distribution of the identified proteins of SJTD-1 depending on pI value proteomeproteome proteome proteome

將分離得到的蛋白進行等電點pI值分析，結(jié)果示于圖6。從圖6可以看出：大部分蛋白等電點處于5～6；而offline-2DLC-MS鑒定到的pI≤8蛋白數(shù)目高于SDS-PAGE-1DLC-MS方法；鑒定到的pI≥9蛋白數(shù)目低于SDS-PAGE-1DLC-MS方法。可見offline-2DLC-MS方法能夠?qū)崿F(xiàn)pI≤8蛋白的高效鑒定，這與前人的研究結(jié)果一致[14-15]。這可能是由于在不同pH值環(huán)境下，多肽的反相保留行為不同，用一維高pH值反相色譜，二維低pH值反相色譜組成的分離多肽混合物，能顯著提高2DLC分離效率，改善峰形，提高峰容量[16-17]。雖然一維高pH值反相色譜和二維低pH值反相色譜組成的2DLC能夠在整體上大幅地提高多肽的鑒定效率，但是offline-2DLC-MS對pI≥9蛋白的鑒定能力不如SDS-PAGE-1DLC-MS，可能是由于隨著多肽堿性提高，色譜柱效下降嚴重，無法達到中性化合物所需的柱效[18]。另外，銅綠假單胞菌蛋白質(zhì)組本身在等電點分布方面與其他物種的蛋白質(zhì)組分布相似[14,19-20]。因此，2DLC-MS對不同等電點蛋白的鑒定效率不同，這與銅綠假單胞菌蛋白質(zhì)組本身的組成無關(guān)，而與2DLC分離能力有關(guān)。

綜上所述，對于相對分子質(zhì)量較大和pI≤8的細菌蛋白質(zhì)鑒定，offline-2DLC-MS無疑是更好的鑒定方法，在后續(xù)的研究中，可以通過優(yōu)化offline-2DLC-MS方法的一維洗脫條件，或者提高SDS-PAGE-1DLC-MS方法中切膠組分的數(shù)目來提高檢測靈敏度和分辨率，進而鑒定到更多數(shù)目的可信蛋白[21-22]。

2.3 數(shù)據(jù)分析

利用SDS-PAGE-1DLC-MS和offline-2DLC-MS技術(shù)方法對共同鑒定到的蛋白進行GO蛋白生物學過程、GO蛋白生物學功能和蛋白亞細胞定位、代謝通路富集等分析。

通過GO注釋對蛋白功能進行聚類分析，結(jié)果示于圖7a。鑒定的蛋白中47%主要集中在代謝過程，這與銅綠假單胞菌是一種代謝過程多樣的菌株有關(guān)。分子功能主要集中在起催化功能的相關(guān)蛋白，示于圖7b；蛋白亞細胞定位示于圖7c，蛋白主要分布在細胞質(zhì)和細胞質(zhì)膜上。利用David 網(wǎng)站相關(guān)軟件進行KEGG代謝通路富集[23]，結(jié)果列于表1。表1中排名前10的代謝通路均為合成與分解代謝，其中包括核酸、脂肪酸代謝以及一些氨基酸代謝，這些通路與烷烴降解轉(zhuǎn)化為脂肪酸，最后經(jīng)過脂肪酸代謝與TCA循環(huán)過程相關(guān)。后續(xù)的實驗將以烷烴為唯一碳源培養(yǎng)SJTD-1菌株，研究以上相關(guān)代謝途徑是否加強，以及相關(guān)蛋白表達是否提高，以找到烷烴分解代謝的相關(guān)蛋白，目前這部分工作正在進行。

注：a.蛋白生物學過程；b.蛋白生物學功能；c.蛋白亞細胞定位圖7 GO功能分析總蛋白Fig.7 Protiens were classified by GO annotations

3 結(jié)論

利用SDS-PAGE-1DLC-MS和offline-2DLC-MS兩種不同的技術(shù)路線，鑒定了銅綠假單胞菌SJTD-1的全蛋白質(zhì)。通過比較兩種方法，分析在細菌蛋白鑒定上的優(yōu)劣，以提高蛋白質(zhì)的鑒定水平；另外，本實驗結(jié)果可為生物蛋白質(zhì)組的鑒定提供借鑒，尤其是在以后銅綠假單胞菌膜蛋白和特定相對分子質(zhì)量蛋白鑒定時，可選擇不同的技術(shù)路線來滿足不同的實驗需求。為進一步分析銅綠假單胞SJTD-1與石油分解相關(guān)的關(guān)鍵代謝通路和相關(guān)蛋白提供了重要信息。

表1 全蛋白的KEGG代謝通路富集

注：富集分值≥1.3表示有意義；P值：Fisher's exact test值，P值≤0.1表示有意義； 數(shù)目：在該條目下聚類到的蛋白數(shù)

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Proteome Analysis of Pseudomonas Aeruginosa SJTD-1

SUN Wen-bing1, HOU Jing-li2

(1.CollegeofLifeandBiotechnologyofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,China;2.InstrumentalAnalysisCenterofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,China)

In recent years, oil spill and its impact on marine environment occurs frequently. To solve this problem, study of oil degrading was put on the agenda. A kind of pseudomonas aeruginosa named SJTD-1 was isolated from soil contaminated by crude oil. SDS-PAGE-1DLC-MS and offline-2DLC-MS methods were used to analysis proteome of SJTD-1 respectively. 1 453 proteins with SDS-PAGE-1DLC-MS and 1 623 protenis with offline-2DLC-MS were identified， respectively， and the total identified proteins were 1 912 by the two methods. Comparing the two different techniques, offline-2DLC-MS method is more benefit to identify membrane proteins, proteins with molecular weight larger than 30 ku and proteins with pI value less than or equal with eight. GO functional annotation, cellular component, functional enrichment and clustering were used to analysis the total proteins. The proteome analysis of pseudomonas aeruginosa SJTD-1 would promote the application on marine environment bioremediation by SJTD-1.

pseudomonas aeruginosa;proteome; SDS-PAGE; offline-2DLC

2014-05-09;

2014-07-15

酵母RNaseH2磷酸化調(diào)控機制及其生理功能的研究項目(31200062)資助

孫文兵(1988—)，男(漢族)，安徽人，碩士研究生，生物化學與分子生物學專業(yè)。E-mail: swb1008@sjtu.edu.cn

侯敬麗(1977—)，女(漢族)，山東人，副研究員，從事生物質(zhì)譜與蛋白質(zhì)組學研究。E-mail: hopie00@sjtu.edu.cn

時間：2014-12-02；

http:∥www.cnki.net/kcms/doi/10.7538/zpxb.youxian.2014.0069.html

O657.63

A

1004-2997(2015)03-0193-06

10.7538/zpxb.youxian.2014.0069