山東地區(qū)生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門菌毒力基因攜帶狀況分析

劉鮮鮮，王 娟，張 倩，趙建梅，曲志娜，王玉東，孫佳怡，黃秀梅，鄒 明，王君瑋

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266109；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心動(dòng)物產(chǎn)品安全檢測(cè)室，山東青島266032；3.黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島266555）

山東地區(qū)生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門菌毒力基因攜帶狀況分析

劉鮮鮮1，2，王 娟2，張 倩3，趙建梅2，曲志娜2，王玉東2，孫佳怡1，黃秀梅2，鄒 明1，王君瑋2

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266109；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心動(dòng)物產(chǎn)品安全檢測(cè)室，山東青島266032；3.黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島266555）

為了了解山東地區(qū)生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門菌毒力基因攜帶狀況，為進(jìn)一步開展沙門菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。采集山東地區(qū)5個(gè)不同生豬屠宰場(chǎng)樣品1 000份，分離沙門菌，鑒定血清型，并對(duì)mog A、sse L、spv C、spv R、his J、fli C等6種毒力基因進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果共分離得到沙門菌菌株188株，分離率為18.8%。鑒定出9種血清型，以德爾卑沙門菌（S.derby）、鼠傷寒沙門菌（S.typhimurium）、湯卜遜沙門菌（S.thompson）為主。上述6種毒力基因均有檢出，其中，mog A檢出率為76.70%，his J檢出率為62.77%，兩種毒力質(zhì)粒spv R、spv C的檢出率較低，僅分別為3.19%和1.06%，且同時(shí)含有多種毒力基因的沙門菌菌株較少。不同地區(qū)屠宰場(chǎng)毒力基因攜帶狀況存在較大差異。表明山東地區(qū)生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門菌毒力基因攜帶狀況不同，沙門菌污染較嚴(yán)重，應(yīng)采取措施降低生豬屠宰中沙門菌的污染，減少食物中毒事件。

豬；屠宰；沙門菌；毒力基因

沙門菌（Salmonella）是一種全球范圍內(nèi)重要的食源性致病菌，主要寄生在人和動(dòng)物腸道內(nèi)，感染動(dòng)物和人后，可引起多種疾病，給人畜健康和公共衛(wèi)生安全帶來嚴(yán)重威脅。沙門菌種類繁多，世界上已發(fā)現(xiàn)2 500多種沙門菌血清型，我國(guó)發(fā)現(xiàn)了292種［1］。其中對(duì)人類危害較大的為鼠傷寒、腸炎以及德爾卑沙門菌等［2］。

近年來，食品中毒事件引起了人們的高度關(guān)注，據(jù)統(tǒng)計(jì)，70%-80%的食品中毒事件由沙門菌引起［3］，而豬肉產(chǎn)品作為沙門菌的重要載體，其質(zhì)量安全倍受關(guān)注。生豬屠宰環(huán)節(jié)由于環(huán)節(jié)較多，屠宰工具、環(huán)境以及人員與豬肉產(chǎn)品頻繁接觸，是沙門菌污染豬肉產(chǎn)品的源頭。

沙門菌致病性是毒力相關(guān)因子相互作用的結(jié)果，而這些毒力基因主要分布在毒力島、毒力質(zhì)粒、鞭毛和脂多糖。目前沙門菌的毒力島研究比較全面的為SPI1、SPI2、SPI3、SPI4、SPI5。相關(guān)研究［4-5］表明，攜帶SPI1和SPI2與同時(shí)攜帶5種毒力島的致病性大致相同。故而本研究選擇了SPI1的核心蛋白mog A基因和SPI2的核心蛋白sse L基因研究沙門菌毒力基因攜帶狀況。沙門菌毒力質(zhì)粒spv基因有利于沙門菌在腸外組織細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)，其產(chǎn)物與細(xì)菌的粘附、定植及血清抗性等毒力表型密切相關(guān)。spv基因含有spv R、spv A、spv B、spv C、spv D 5個(gè)開放閱讀框。其中，spv R編碼LysR/metR家族轉(zhuǎn)錄活化因子的細(xì)菌調(diào)節(jié)性蛋白，并使基因按照合成spv ABCD的方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，spv C編碼-大小為28 ku的蛋白質(zhì)［6-7］，能夠抑制MAP磷酸激酶。沙門菌鞭毛蛋白可引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，是沙門菌重要的致病因素，由fli C或fli B編碼。his J為組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)基底結(jié)合蛋白，可使組氨酸降解成氨，影響組氨酸的合成。

本研究從生豬屠宰環(huán)節(jié)采集樣品，研究山東生豬屠宰環(huán)節(jié)中沙門菌的污染以及毒力基因攜帶狀況，初步了解豬肉產(chǎn)品較易出現(xiàn)交叉污染的環(huán)節(jié)，毒力基因的毒力強(qiáng)弱，以期制定減少?gòu)?qiáng)致病性沙門菌污染的措施，降低流通至市場(chǎng)的豬肉產(chǎn)品沙門菌污染率，保障豬肉產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 樣品來源2014年3月至12月間，自山東地區(qū)不同生豬屠宰場(chǎng)采集樣品，屠宰場(chǎng)A、B、C、D、E分別采集樣品182份、261份、192份、180份、185份，共1 000份。標(biāo)記后，冷藏運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離鑒定并保存。

1.2 參考菌株毒力基因參考菌株mog A、sse L、spv C、spv R、his J、fli C等基因陽(yáng)性菌株均由農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 血清型鑒定按照文獻(xiàn)［8］中的方法和產(chǎn)品說明書，用沙門菌屬O抗原診斷血清鑒定所保存的沙門菌陽(yáng)性菌株血清型，被A～F多價(jià)O血清凝集的菌株，進(jìn)一步用O型單因子血清作玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行分型確定。

1.4 毒力基因引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)［5，9］發(fā)表的沙門菌mog A、sse L、spv C、spv R、his J、fli C毒力基因序列，設(shè)計(jì)合成6對(duì)沙門菌毒力基因擴(kuò)增引物，見表1。

表1 6對(duì)沙門菌毒力基因引物

1.5 毒力基因的檢測(cè)以188株沙門菌分離株的DNA為模板，利用6對(duì)毒力基因引物進(jìn)行毒力基因檢測(cè)。反應(yīng)體系為25μL：Green Mix 12.5μL，去離子水9.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5 μL，DNA模板2μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，Tm退火30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)。

取7μL PCR產(chǎn)物與1μL 10×Glycerol DNA Loading Buffer混勻，產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳成像后，觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 不同屠宰環(huán)節(jié)沙門菌污染狀況生豬屠宰環(huán)節(jié)較多，豬肉產(chǎn)品更易受到沙門菌污染，不同屠宰環(huán)節(jié)沙門菌檢出率差異較大，分別為3%～50%，見圖1。

2.2 血清分型結(jié)果利用玻片凝集試驗(yàn)對(duì)沙門菌分離株進(jìn)行血清型鑒定，檢出率較高的3種主要血清型分別為S.derby（n=80）、S.typhimurium（n= 56）、S.thompson（n=34），其次為S.agona（n=3）、S. enteritidis（n=1）S.tsevie（n=2）S.lagos（n=1）、S.oritam?erin（n=1）、S.lomita（n=2），且有8株沙門菌不能定型。

2.3 毒力基因攜帶狀況沙門菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，6種毒力基因均有檢出見圖2，其中mo?g A和his J基因的檢出率最高，分別高達(dá)76.60%和62.77%，其次為fli C和sse L基因，檢出率分別為34.04%和27.66%。兩對(duì)質(zhì)粒毒力基因spv C、spv R分離率較低，分別為3.19%、1.06%，見表2。

圖1 山東部分地區(qū)生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門菌污染狀況比較■：不同屠宰環(huán)節(jié)沙門菌污染率/%

圖2 沙門菌分離株毒力基因PCR產(chǎn)物的電泳圖M：DNAMarker DL-2 000；1：spv Cgene；2：mog A gene；3：his Jgene；4：sse L gene；5：fliC gene；6：spv R gene

表2 不同屠宰場(chǎng)6種毒力基因檢出數(shù)

3 討論

3.1 污染狀況分析生豬屠宰環(huán)節(jié)是沙門菌污染豬肉制品的源頭和關(guān)鍵。本研究沙門菌總污染率為18.80%，與李郁［10］研究調(diào)查屠宰場(chǎng)沙門菌污染狀況接近，高于侯小剛等［11］屠宰場(chǎng)胴體污染率10.71%。生豬屠宰環(huán)節(jié)中，肛門拭子、脫毛后、剝皮后、劈半前、后胴體表面以及剝皮工具的污染率較高。肛門拭子中分離的沙門菌大多為生豬本身帶有或從待宰圈及運(yùn)輸車等感染或污染，攜帶率較高則可能在屠宰過程中污染其他健康豬只，造成嚴(yán)重的交叉污染。

3.2 血清型分析對(duì)所分離沙門菌陽(yáng)性菌株進(jìn)行血清學(xué)鑒定，共鑒定出9種血清型，以S.Derby、S.Typhimurium、S.Thompson為主，分離率分別為42.5%、29.8%、18.1%。由此可知，山東部分地區(qū)生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門菌的優(yōu)勢(shì)血清型為S.Derby，與侯小剛等［11］研究的沙門菌優(yōu)勢(shì)血清型一致。

3.3 毒力基因攜帶狀況沙門菌致病性主要與沙門菌毒力島和毒力質(zhì)粒基因相關(guān)［12］。理論上，沙門菌所攜帶的毒力基因種類越多，其對(duì)人類健康存在的潛在威脅越大。本研究中6種毒力基因均有檢出，5個(gè)生豬屠宰場(chǎng)毒力基因攜帶狀況存在一定差異，尤其兩對(duì)毒力質(zhì)?；?，僅有屠宰場(chǎng)B和C有檢出，檢出率較低。生豬屠宰場(chǎng)A、B、C、E均有mog A、sse L、his J、fli C 4種毒力基因的檢出，且檢出率較高。而屠宰場(chǎng)D僅有一種毒力基因的檢出，沙門菌潛在的危險(xiǎn)性較低。屠宰場(chǎng)A、B、C、D沙門菌攜帶的毒力基因均以mog A為主，攜帶率高達(dá)91%、83%、100%、71%，與王晶鈺等［9］市售鮮雞蛋中毒力島基因mog A檢出率接近。屠宰場(chǎng)E以his J為主，攜帶率高達(dá)97%，mog A攜帶率為66%。

分析不同屠宰環(huán)節(jié)沙門菌毒力基因攜帶情況，同時(shí)含mog A、sse L、his J和fli C基因的菌株共16株，含mog A、sse L和his J基因的共44株，含mog A、his J和fli C基因的共32株，含mog A、sse L和fli C的共有18株，含sse L、his J和fli C共16株，含mog A和his J、mog A和sse L、his J和fli C、mog A和fli C、sse L和his J基因的分別為80株、52株、50株、44株、44株。同時(shí)含4種毒力基因的16株沙門菌，2株來自剝皮前胴體表面，4株來自剝皮后胴體表面，2株來自脫毛后胴體表面，4株來自劈半后胴體表面，2株來自剝皮工具，2株來自劈半工具；同時(shí)含有mog A和sse L基因的26株沙門菌也均來自以上環(huán)節(jié)，因而這些環(huán)節(jié)沙門菌具有較強(qiáng)的致病性，應(yīng)引起重視并采取措施加以控制。由于其主要從生豬肛門拭子、剝皮前后胴體表面、劈半前后胴體表面以及剝皮工具分離得到，提示在屠宰過程中應(yīng)注意防止交叉污染，提高屠宰工具的消毒頻率，同時(shí)應(yīng)對(duì)宰前的生豬進(jìn)行嚴(yán)格檢疫。

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Analysis of virulence genes of Salm onella isolated from pig slaughtering process in Shandong province

LIU Xian-xian1，2，WANG Juan2，ZHANGQian3，ZHAO Jian-mei2，QU Zhi-na2，WANG Yu-dong2，SUN Jia-yi1，HUANG Xiu-mei2，ZOUMing1，WANG Jun-wei2
（1.Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Laboratory of Safety for Animal Products，China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032，China；3.Huangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266555，China）

To understand the virulence gene carriage condition of Salmonella during pig slaughtering in Shandong Province，and provide basic data for further the risk assessment of Salmonella.Collected 1000 samples from 5 different size pig slaughter?house links，and then isolated Salmonella，and detected mogA，sseL，spvC，spvR，hisJ，fliC virulence genes using PCR.188 Salmo?nella strainswere isolated.The isolated ratewas 18.8%.our results showed that9 serotypeswere identified，and theyweremainly S. derby，S.typhimurium，and S.thompson.Six virulence geneswere analyzed and the detection rate ofmogA was 76.70%and the de?tection rate of hisJwas 62.77%.However，the detection rate of spvR and spvC were low，only 3.19%and 1.06%，respectively.The Salmonella strains containingmultiple virulence geneswere rare.There was big difference in virulence gene carriage in the slaugh?terhouse of different areas.Salmonella in links of pig slaughtering in Shandong area were carrying different degrees of virulence genes，and Salmonella contamination was severe.Therefore，good manufacturing practices need to be implemented，and measures are required to reduce salmonella contamination duing pig slaughter to reduce the occurrence of food poisoning.

pig；slaughtering；Salmonella；virulence gene

s：WANG Jun-wei；ZOUMing

S852.65+1

A

0529-6005（2015）12-0083-03

2015-05-21

國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估專項(xiàng)（2015）（GJFP-201500803）

劉鮮鮮（1990-），女，碩士生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理學(xué)，E-mail：312749043@qq.com

王君瑋，E-mail：yffs2000@sina.com；鄒明，E-mail：zoudnet@163.com