四川達(dá)州地區(qū)山羊偽結(jié)核棒狀桿菌病的診斷及藥敏試驗(yàn)

張夢(mèng)思，李和賢，周作勇

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶榮昌402460）

四川達(dá)州地區(qū)山羊偽結(jié)核棒狀桿菌病的診斷及藥敏試驗(yàn)

張夢(mèng)思，李和賢，周作勇

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶榮昌402460）

自2014年以來(lái)，四川達(dá)州地區(qū)眾多羊場(chǎng)所飼養(yǎng)的山羊皮膚出現(xiàn)“長(zhǎng)包”現(xiàn)象，有的羊場(chǎng)發(fā)病率甚至高達(dá)30%，但該病致死率很低。隨著該病在羊群中越來(lái)越多，很難徹底根除，且導(dǎo)致山羊生產(chǎn)性能明顯降低，才引起飼主重視。2015年5月，筆者對(duì)達(dá)州地區(qū)宣漢縣發(fā)病山羊采集病料，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確診為山羊偽結(jié)核棒狀桿菌病，進(jìn)一步進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，為該地區(qū)用藥提供指導(dǎo)，報(bào)告如下。

1 發(fā)病情況

不同品種的山羊均可發(fā)病，主要發(fā)生于3月齡以上，以成年羊?yàn)橹鳎?～2月齡羔羊極少發(fā)生?；疾⊙蚨鄶?shù)呈慢性經(jīng)過(guò)，主要在頭頸部、肩前、股前甚至乳房等處出現(xiàn)局灶性腫塊，俗稱“包”，其大小不一。隨著病情的發(fā)展，包塊逐漸腫脹、增大，大者可達(dá)鴨蛋大小，初期觸之較硬，之后開始化膿變軟，并有波動(dòng)感，發(fā)展到后期淺表的膿腫自行破潰，流出乳白色濃稠的牙膏狀膿汁，膿汁排后數(shù)日傷口會(huì)痊愈，但常會(huì)在原處或者其周圍發(fā)生新的膿腫，整個(gè)病程大多為1個(gè)月左右，有的可達(dá)3個(gè)月。患病山羊極少發(fā)生死亡，部分發(fā)病羊表現(xiàn)為皮膚瘙癢，經(jīng)常相互摩擦或在墻上摩擦，嚴(yán)重的病羊出現(xiàn)全身性感染，表現(xiàn)為咳嗽、食欲下降、體重下降。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 病料采集以5mL無(wú)菌注射器從發(fā)病癥狀典型的兩頭波爾山羊膿腫中抽取膿汁（見中插彩版圖1），低溫送回實(shí)驗(yàn)室待檢。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)將病料分別接種在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、普通營(yíng)養(yǎng)肉湯、含10%犢牛血清的肉湯、麥康凱瓊脂和血平板瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落形態(tài)。結(jié)果：從所采集的兩個(gè)膿汁樣本中均分離出細(xì)菌（編號(hào)分別為XH-1和XH-2），細(xì)菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和普通營(yíng)養(yǎng)肉湯內(nèi)生長(zhǎng)不良，但在含10%犢牛血清的肉湯內(nèi)生長(zhǎng)良好，接種24 h血清肉湯明顯變渾濁，且有白色菌膜出現(xiàn)，試管底有顆粒樣物質(zhì)沉淀。分離菌在血瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，接種24 h出現(xiàn)針尖大小的菌落，48 h后出現(xiàn)1mm大小，灰白色、不透明、干燥、中央凸起、邊緣不整齊的菌落，菌落在培養(yǎng)基上附著不牢，鉑金耳易將其滑動(dòng)卻難挑起，該菌在血平板上面出現(xiàn)狹窄β型溶血環(huán)，但傳代后不溶血。在麥康凱培養(yǎng)基上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.3 涂片鏡檢將培養(yǎng)物涂片進(jìn)行革蘭染色鏡檢，可見大量球桿狀的革蘭陽(yáng)性菌，無(wú)莢膜、鞭毛和芽孢，多呈散在分布，該菌的排列與葡萄球菌的排列頗為相似（見中插彩版圖2）。2.4細(xì)菌16S rDNA的擴(kuò)增、測(cè)序及分析以細(xì)菌基因組提取試劑盒分別提取分離菌的基因組DNA，以16S rDNA通用引物（上游5′-AGAGTTT?GATCCTGGCTCAG-3′，下游5′-CGGCTACCTTGT?TACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果，兩個(gè)分離株均獲得長(zhǎng)度約為1 500 bp的擴(kuò)增片段（見中插彩版圖3）。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序，分別獲得的序列長(zhǎng)度為1 398 bp和1 394 bp，經(jīng)Blast在線比對(duì)分析，2株分離菌16S rDNA序列與Gen?Bank已收錄的偽結(jié)核棒狀桿菌（ATCC 19410，登錄號(hào)為NR_115562.1）相應(yīng)的基因序列同源性最高，分別為98%和99%，結(jié)合兩株細(xì)菌的培養(yǎng)特性及染色特點(diǎn)確定分離菌為山羊偽結(jié)核棒狀桿菌。2.5致病性試驗(yàn)取山羊偽結(jié)核棒狀桿菌在含10%犢牛血清肉湯的24 h純培養(yǎng)物進(jìn)行試驗(yàn)：（1）對(duì)小鼠的致病性試驗(yàn)：將小鼠分為1個(gè)對(duì)照組，分離菌接種1組和2組，每組3只，分離菌接種組小鼠經(jīng)腹腔注射對(duì)應(yīng)菌液0.3mL，對(duì)照組注射含10%犢牛血清肉湯0.3mL。結(jié)果分離菌接種組小鼠在2 d內(nèi)全部死亡，從死亡小鼠肝臟中分離獲得與接種菌一致的致病菌，而對(duì)照組小鼠仍健康存活。證實(shí)所分離的偽結(jié)核棒狀桿菌具有較強(qiáng)的致病性；（2）感染途徑試驗(yàn)：取健康小白鼠10只，分灌胃組、滴鼻組、皮下注射組、腹腔注射組和對(duì)照組，每組2只。對(duì)照組腹腔注射10%犢牛血清肉湯，其余試驗(yàn)組小鼠按相應(yīng)途徑每只接種0.1mL菌液。結(jié)果腹腔注射的兩只小鼠在3 d內(nèi)死亡；皮下注射的兩只在第8天左右注射部位開始膿腫，11 d左右自行破潰，流出黃綠色膿汁，13 d左右開始結(jié)痂愈合，病情發(fā)展快者在原處附近又開始發(fā)生新的膿腫，14 d將其致死剖檢發(fā)現(xiàn)其僅頸部淋巴結(jié)腫大，內(nèi)部器官并無(wú)明顯眼觀病變；其余6只小鼠于14 d撲殺，剖檢發(fā)現(xiàn)灌胃的小鼠僅腸壁上有少量米粒大小的膿包，而滴鼻的小鼠在其腸壁、腎臟上面有米粒至豌豆大小不等的膿包，胸腺腫大。對(duì)照組小鼠無(wú)異常表現(xiàn)和剖檢病變。本試驗(yàn)證實(shí)偽結(jié)核棒狀桿菌可以經(jīng)多途徑感染發(fā)病。

2.6 藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，用滅菌的涂布棒將100μL偽結(jié)核棒狀桿菌菌液均勻涂布在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，待菌液被完全吸收后，將不同的藥敏試驗(yàn)貼在培養(yǎng)基的適當(dāng)位置，37℃培養(yǎng)24 h，觀察記錄抑菌圈大小，判定依照美國(guó)CLSI標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果2株分離菌藥敏譜基本一致，大部分抗生素對(duì)偽結(jié)核棒狀桿菌均有一定的抑制作用，其中分離菌對(duì)四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星、米諾環(huán)素、頭孢西叮、克拉霉素及羅紅霉素等13種藥物高度敏感；XH-1和XH-2對(duì)甲氧嘧啶和頭孢曲松分別為中敏和高敏；對(duì)呋喃妥因和呋喃唑酮?jiǎng)t表現(xiàn)為完全耐藥（表1）。

表1 偽結(jié)核棒狀桿菌藥敏試驗(yàn)

3 討論

3.1 根據(jù)上述臨床癥狀，分離菌形態(tài)、培養(yǎng)特性，分離細(xì)菌16S rDNA序列的同源性比對(duì)結(jié)果，以及致病性特點(diǎn)，可判定該羊場(chǎng)山羊所患病為偽結(jié)核棒狀桿菌病。

3.2 羊偽結(jié)核棒狀桿菌病是由偽結(jié)核棒狀桿菌引起的一種人畜共患慢性傳染病，國(guó)外多稱之為干酪樣淋巴結(jié)炎（CLA）［1］。本病在世界上養(yǎng)羊的各個(gè)地區(qū)都普遍存在，我國(guó)內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、新疆、云南、貴州、上海、浙江、廣西和廣東等地均有報(bào)道［2］，而在四川省僅見攀枝花有過(guò)報(bào)道［3-4］。由于該病發(fā)病緩慢，且致死率一般較低，所以常常被人們忽視。據(jù)調(diào)查很多養(yǎng)殖場(chǎng)山羊首次發(fā)病時(shí)，養(yǎng)殖戶均會(huì)采取措施進(jìn)行處理，如對(duì)發(fā)病羊注射抗生素，同時(shí)切開膿腫進(jìn)行排膿清洗消包等，隨后發(fā)現(xiàn)該病不易造成死亡，很多情況下均不再做任何處理，而是讓膿瘡自行破潰、流膿結(jié)痂。因膿汁外流極易將病原傳播給同群山羊和污染環(huán)境，這也是該地區(qū)山羊偽結(jié)核棒狀桿菌病年年發(fā)生的重要原因。近年來(lái)，西南地區(qū)山羊養(yǎng)殖量快速增多，山羊偽結(jié)核棒狀桿菌病呈現(xiàn)出大面積流行，感染嚴(yán)重時(shí)可造成生產(chǎn)性能下降甚至死亡，加之該菌對(duì)人也有致病性，需引起人們的足夠重視。

3.3 羊偽結(jié)核棒狀桿菌病是難以治療的傳染病之一，一旦侵入羊群則很難徹底清除。目前，治療該病的方法主要有藥物和手術(shù)治療。用于該病防治的藥物包括多種抗生素和中草藥等，本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，山羊偽結(jié)核棒狀桿菌對(duì)很多種抗生素敏感，這可能與該地區(qū)抗生素在山羊上使用較少有關(guān)。然而資料報(bào)道，多種抗生素在臨床上治療效果并不理想，其原因可能是：（1）包囊膜為一層厚而致密的纖維性肉芽腫，諸多藥物難以通過(guò)，無(wú)法滲入其內(nèi)；（2）偽結(jié)核棒狀桿菌可寄生于細(xì)胞內(nèi)，使得一些藥物對(duì)其難以發(fā)揮作用；（3）包囊內(nèi)膿汁干稠，藥物難以均勻地?cái)U(kuò)散于整個(gè)膿腫，不能徹底殺死膿腫內(nèi)的病原菌。因此，在對(duì)患羊進(jìn)行藥物治療的同時(shí)，采取手術(shù)切開其膿腫排膿，清洗消毒，療效會(huì)更好。馬成貴等人用此法治療多例，均1次治愈［5］。

3.4 由于臨床用藥物防治羊偽結(jié)核棒狀桿菌病不理想，目前也無(wú)可有效防治該病的疫苗，因此采取綜合性的預(yù)防措施才是防治該病的根本。不要從有偽結(jié)核病史的羊場(chǎng)引種，隔離飼養(yǎng)并及時(shí)治療發(fā)病羊，嚴(yán)格消毒和清除病羊排出的膿汁，避免污染周圍場(chǎng)所及飼草。同時(shí)應(yīng)視情況淘汰患羊以凈化羊群［6］。

［1］Seyfert N，Silva R F，Jardin J，etal.Serological proteome analysis of Corynebacterium pseudotuberculosis isolated from different hosts reveals novel candidates for prophylactics to control caseous lymphadenitis［J］.Veterinary Microbiology，2014，174：255-260

［2］鄭敏，胡杰，歐紹毅，等.廣西黑山羊偽結(jié)核棒狀桿菌的分離與鑒定［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，41（10）：1128.

［3］楊應(yīng)東，童俊青，陳明華，等.四川某圈養(yǎng)山羊場(chǎng)干酪性淋巴結(jié)炎病的調(diào)查與措施建議［J］.攀枝花科技與信息，2011，36（3）：46-47.

［4］曾澤，韋雷飛，黃秀君，等.一起山羊偽結(jié)核棒狀桿菌感染的診斷［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（3）：131-133.

［5］馬成貴，王小虎.山羊“長(zhǎng)包”病防治的體會(huì)［J］.養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn)，2012，9：85.

［6］宋先利.山羊偽結(jié)核病的診治要點(diǎn)［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘，2013，29（6）：143.

S852.61+8

B

0529-6005（2015）12-0054-02

2015-7-24

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（XDJK20-15C030）；西南大學(xué)博士啟動(dòng)基金（2013Bsr07）

張夢(mèng)思（1995-），女，本科生，學(xué)習(xí)方向?yàn)閯?dòng)物醫(yī)學(xué)，E-mail：1418121852@qq.com

周作勇，E-mail：zzyxnny@163.com