市販雞肉中一株腸出血性大腸桿菌O157:H7的分離

藺 露，姚 璐，孫 燕，謝建華，葉潔瑩，張 雪，盧 露

（1.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心，重慶渝北401120；2.西南大學(xué)，重慶北碚400715）

市販雞肉中一株腸出血性大腸桿菌O157:H7的分離

藺 露1，姚 璐1，孫 燕1，謝建華1，葉潔瑩1，張 雪2，盧 露2

（1.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心，重慶渝北401120；2.西南大學(xué)，重慶北碚400715）

大腸桿菌O157:H7是一種腸道出血性大腸桿菌（EHEC），屬于腸桿菌科埃希菌屬，該型具有很強(qiáng)的耐酸和耐低溫能力，可產(chǎn)生大量的Vero毒素引起人和動物出現(xiàn)腸出血性腹瀉，兒童與老人易感染出現(xiàn)此癥；嚴(yán)重時(shí)并發(fā)腎衰竭，病死率高，具有莢膜、鞭毛和菌毛；其最適生長溫度為30℃～42℃，且廣泛分布于自然界，人與人之間或人與家畜之間通過糞污染物經(jīng)口途徑傳播。繼1982年美國首次發(fā)生EHEC引起人的食物中毒事件以后，腸出血性大腸桿菌造成的食源性或水源性污染問題正日益嚴(yán)重［1］。

為了解重慶、云南、陜西三省市的屠宰場、超市和農(nóng)貿(mào)市場環(huán)境和畜禽肉產(chǎn)品中大腸桿菌O157:H7的污染情況，我們對3個省市12個屠宰場、7個超市和13個農(nóng)貿(mào)市場的769份樣品進(jìn)行了大腸桿菌O157:H7的分離與鑒定，獲得了1株大腸桿菌O157:H7菌株，命名為WL05D01。

1 材料與方法

1.1 樣品采集2014年我們從重慶市的合川、江津、萬州、黔江、長壽、武隆以及陜西省的西安和云南省昆明采集樣本共769份，其中來自屠宰場、農(nóng)貿(mào)市場、超市的豬肉樣品有173份、雞肉樣品184份、環(huán)境拭子樣品412份，見表1。

表1 大腸桿菌O157:H7樣品采集與分布

1.2 儀器與試劑生物學(xué)顯微鏡；梯度PCR儀；Ⅱ級生物安全柜等。Dynabeads anti-E.Coli O157（IMPs）和OXOID藥敏紙片，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；大腸桿菌O157顯色培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司和博賽生物技術(shù)股份有限公司；API-20E，購自法國生物梅里埃；大腸埃希菌診斷血清，購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；大腸桿菌O157:H7標(biāo)準(zhǔn)菌株EK274，西北農(nóng)林大學(xué)楊保偉贈。

1.3 大腸桿菌的前期增菌取樣品至BPW均質(zhì)袋，37℃搖床培養(yǎng)4～6 h后；取1 mL培養(yǎng)液加入EC肉湯，37℃培養(yǎng)24 h。

1.4 免疫磁珠與分純按大腸桿菌O157免疫磁珠試劑盒說明書操作，取經(jīng)免疫磁珠吸附的菌液在廣東環(huán)凱大腸桿菌O157顯色培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)24 h；挑取可疑菌落劃線于博賽科瑪嘉O157顯色培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。

1.5 生化鑒定按梅里埃API-20E試劑盒說明書進(jìn)行可疑菌株的生化試驗(yàn)。

1.6 血清型鑒定O抗原分型，利用玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行；H抗原分型，利用試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行。

1.7 多重PCR鑒定按照大連寶生物TaKaRa Ex Taq?試劑盒說明書進(jìn)行。多重PCR引物參照美國FDA提供的大腸桿菌O157:H7診斷引物，其中包括目的基因：stx1、stx2、+93uid A、γ-eae A、ehx A，共5段，詳見表2；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性15 min，95℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，25個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上110 V電泳30min后觀察多重PCR結(jié)果。

表2 大腸桿菌O157：H7多重PCR引物

1.8 藥敏紙片試驗(yàn)將菌株接種至MH液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24 h。將菌液比濁為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，然后?00μL菌液于MH固體培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻后，貼上藥敏紙片，37℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌對藥敏紙片的敏感程度，重復(fù)試驗(yàn)3次，判定參照美國NCCLS標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)特性經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室初篩，我們從來自重慶市武隆縣某農(nóng)貿(mào)市場的雞肉樣品中，分離出1株可疑的O157菌株，命名為WL05D01。WL05D01在廣州環(huán)凱大腸桿菌O157顯色培養(yǎng)基上生長呈紫紅色，菌落扁平透明，邊緣光滑；在博賽科瑪嘉O157顯色培養(yǎng)基上呈淺紅色至淺紫色，中心灰褐色的菌落，經(jīng)革蘭染色，鏡檢呈革蘭陰性，兩端鈍圓，短小桿菌，大小約為0.5×1～3μm。

2.2 生化試驗(yàn)及血清型鑒定WL05D01能發(fā)酵葡萄糖、鼠李糖、密二糖、山梨醇和甘露醇；吲哚試驗(yàn)陽性；V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性；不產(chǎn)生硫化氫（H2S）；O157抗原玻片凝集試驗(yàn)呈陽性；H7抗原試管凝集試驗(yàn)呈陽性。API-20E試劑條結(jié)果為典型大腸埃希菌。

2.3 多重PCR樣品WL05D01與陽性對照（標(biāo)準(zhǔn)菌株EK274）在584 bp、397 bp、348 bp、252 bp、166 bp處均出現(xiàn)了核酸條帶；與stx1、stx2、93ui?d A、eae A、ehx A基因片段大小吻合，見圖1。

圖1 WL05D 01革蘭染色鏡檢（10×100倍）

圖2 WL05D01多重PCR電泳圖譜

2.4 藥敏紙片試驗(yàn)結(jié)果按照美國NCCLS標(biāo)準(zhǔn)選擇了A組（氨芐西林、頭孢噻吩、慶大霉素）、B組（阿米卡星、環(huán)丙沙星、青霉素、頭孢噻肟、頭孢哌酮）和C組（氯霉素、四環(huán)素）中共10種抗生素進(jìn)行藥敏紙片試驗(yàn)，WL05D01僅對B組的青霉素出現(xiàn)了耐受。除此之外，WL05D01對苯唑西林、多粘菌素B、紅霉素也出現(xiàn)了耐受。

3 討論

大腸桿菌O157實(shí)驗(yàn)室分離鑒定耗時(shí)長，目前采用免疫磁珠（IMPs）與膠體金免疫層析法（ICA）能提高大腸桿菌O157的捕獲率［2］，此次我們選用大腸桿菌O157:H7顯色培養(yǎng)基代替?zhèn)鹘y(tǒng)SMAC平皿，以及免疫磁珠（IMPs）對大腸桿菌O157進(jìn)行濃縮捕獲，從市販雞肉中分離出了1株大腸桿菌O157:H7，檢出率僅為0.54%，如果能結(jié)合膠體金免疫層析法（ICA）或許檢出率會有所提高。

由于大腸桿菌的血清型較多，其中作為食源性能感染人的大腸桿菌O157型的菌株一般都有志賀菌素，但有可能不全［3］，志賀菌素是致使感染患者出現(xiàn)出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合征的主要致病因子［4］。丁紅雷等［5］2006年調(diào)查結(jié)果稱，重慶市和三峽庫區(qū)從豬糞便樣品中分離的大腸桿菌O157部分菌株有stx1，所有菌株均缺失stx2；上海趙秋華等［6］從豬場分離的菌株也僅檢出出志賀菌素stx1；此次從農(nóng)貿(mào)市場雞肉樣品中分離的菌株WL05D01里stx1和stx2毒力基因都存在，說明從雞肉中分離的WL05D01有可能是大腸桿菌O157高致病菌株。

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，此次分離的WL05D01菌株按NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，僅對B組有選擇性報(bào)告的藥物中β-內(nèi)酰胺類的青霉素耐受；另外對3種抗生素耐受，其中涉及到大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素）的耐受，這也與柳巨雄等［7-8］研究結(jié)果相同。此次調(diào)查樣品采集的范圍涉及3個省市生豬屠宰場和零售市場，從分離結(jié)果來看生豬屠宰場未檢出大腸桿菌O157型，從生豬屠宰場、農(nóng)貿(mào)市場、超市采集的各個環(huán)節(jié)的環(huán)境拭子也未能分離出大腸桿菌O157型，但從市販雞肉分離出了大腸桿菌O157:H7，證明市販雞肉潛在著被大腸桿菌O157:H7污染的風(fēng)險(xiǎn)，為避免受污染的肉品通過食物鏈進(jìn)入市場造成食源性疾病的暴發(fā)，有關(guān)部門應(yīng)規(guī)范家禽宰殺點(diǎn)屠宰檢疫。

［1］Riley，LeeW，Remis，etal.Hemorrhagic Colitis Associated with a Rare Escherichia coli Serotype［J］.New England Journal ofMedicine，1983，12（308）：681-685.

［2］Hui Qi，Zhen Zhong，Han-Xin Zhou，et al.A rapid and highly sensitive protocol for the detection of Escherichia coli O157:H7 based on immunochromatography assay combined with the enrich?ment technique of immunomagnetic nanoparticles［J］.International Journalof Nanomedicine，2011，6：3033-3039.

［3］A tsushi Iguchi，Hiroki Shirai，Kazuko Seto，et al.W ide Distribu?tion of O157-Antigen Biosynthesis Gene Clusters in Escherichia coli［J］.PLoSOne，2011：6（8）：e23250.

［4］Krystle L，Mohawk，Alison D.O'Brien.Mouse Models ofEsche?richia coliO157:H7 Infection and Shiga Toxin Injection［J］.J Biomed Biotechnol，2011，2011：258185.

［5］丁紅雷.重慶市及三峽庫區(qū)大腸桿菌O157的流行病學(xué)調(diào)查［D］.重慶：西南大學(xué)，2006.

［6］趙秋華，王少輝，劉萍萍，等.上海市閔行區(qū)豬場中大腸桿菌O157：H7的分離鑒定及生物學(xué)特性研究［J］.中國動物傳染病學(xué)報(bào)，2013，2l（3）：38.44.

［7］Khana，Das SC，Ramamurthy T，etal.Antibiotic resistance viru?lence gene and molecular profiles of Shiga toxin-producing Esch?erichia coli isolates from diverse sources in calcutta，india［J］.J Clin Microbiol，2002，40（6）：2009-2015.

［8］柳巨雄.動物源性大腸桿菌O157對β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)機(jī)制的研究［D］.吉林：吉林大學(xué)，2005.

S852.61+2

B

0529-6005（2015）12-0052-03

2015-08-03

農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管（風(fēng)險(xiǎn)評估）項(xiàng)目（GJFP201500803）

藺露（1983-），女，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物疫病防控、實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌學(xué)檢測，E-mail：yokokiki@foxmail.com