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    鵝源鴨疫里默菌的分離鑒定與藥敏試驗

    2015-04-18 10:41:34胡曉苗沈?qū)W懷趙瑞宏侯宏艷潘孝成周學(xué)利張丹俊朱傳明
    中國獸醫(yī)雜志 2015年12期
    關(guān)鍵詞:鴨疫菌液氏桿菌

    胡曉苗,戴 銀,沈?qū)W懷,趙瑞宏,侯宏艷,潘孝成,周學(xué)利,張丹俊,朱傳明

    (安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,安徽合肥230031)

    鵝源鴨疫里默菌的分離鑒定與藥敏試驗

    胡曉苗,戴 銀,沈?qū)W懷,趙瑞宏,侯宏艷,潘孝成,周學(xué)利,張丹俊,朱傳明

    (安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,安徽合肥230031)

    鵝傳染性漿膜炎是由鴨疫里默菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起鵝的以纖維蛋白滲出并在臟器表面沉積,胸、腹腔大量積液為特征的一種接觸傳染性疾病,其特征是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪型輸卵管炎和腦膜炎。2~8周齡鵝多發(fā),發(fā)病率90%,死亡率10%~40%,給養(yǎng)鵝業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)有關(guān)鵝傳染性漿膜炎研究比較少,胡清海[1]研究表明,2株鵝源RA分離株對雛鴨和雛鵝的致病性沒鴨源分離株強(qiáng),而且對雛鵝的致病性比雛鴨強(qiáng)。趙寶華[2]從揚(yáng)州郊區(qū)發(fā)病鵝場分離到1株對鵝具有很強(qiáng)致病性的鵝源RA。呂敏娜[3]分離鑒定出1株血清1型的RA,序列分析顯示,鵝源分離株與鴨源RA處于同一進(jìn)化支上,與雞源RA進(jìn)化關(guān)系稍遠(yuǎn),對鴨和鵝均有高致病性,自家疫苗能夠較好地保護(hù)雛鵝。作者對來自安徽省兩家疑似患有RA鵝群的病料,進(jìn)行了細(xì)菌分離、生化試驗和PCR方法鑒定,分離鑒定出2例鵝源RA,為該病的診斷和防治提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 病料來源選擇兩家鵝場具有典型纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎以及腸炎的病死鵝,無菌操作采集患病鵝的肝臟與腦組織。

    1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)無菌環(huán)境下操作,取病死鵝的肝臟和腦接種在胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA培養(yǎng)基)上,在37℃二氧化碳恒溫箱中培養(yǎng)36 h。若未培養(yǎng)出疑似菌落則重新取樣分離,若存在則挑選平板上數(shù)個圓形、透明、邊緣光滑、奶油狀的菌落平板劃線法在LB培養(yǎng)基上傳代,于37℃CO2恒溫箱中培養(yǎng)36 h~48 h以獲得純培養(yǎng)。

    1.3 革蘭染色取之前純培養(yǎng)的菌做菌液,經(jīng)涂片固定,做革蘭染色。

    1.4 生化試驗鑒定挑取2組新鮮菌液按常規(guī)方法分別進(jìn)行明膠液化試驗、過氧化氫酶試驗、氧化酶試驗、糖發(fā)酵試驗。

    1.5 PCR方法的鑒定

    1.5.1 PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank中發(fā)表的鴨疫里默菌(RA)1-19型16S rRNA基因序列分別與大腸埃希菌等的16S rRNA基因序列比對設(shè)計特異性引物[4]:F:5′-CTGAACACGGTGTACGAATAAG-3′;R:5′-TCTTATACGAGTCCCCAAC-3′,片段大小680 bp。采用20μL體系:RA 16s rRNA F:0.5μL,RA 16 s rRNA R:0.5μL,DNA模板1μL(新鮮菌液),Premix Taq DNA聚合酶10μL,ddH2O補(bǔ)足20μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min,94℃變性30 s,58℃復(fù)性45 s,72℃延伸1min,30個循環(huán),最后72℃溫育8 min。凝膠電泳檢測,取20μL PCR產(chǎn)物混合2μL 10 Loading Buffer在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,另加5μL DL-2 000 DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

    1.5.2 PCR產(chǎn)物的純化與克隆PCR產(chǎn)物純化及與質(zhì)粒pMD18-T的連接分別參照試劑盒的說明書進(jìn)行,連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α、篩選陽性克?。?]。

    1.5.3 重組質(zhì)粒的鑒定將根據(jù)藍(lán)白斑篩選原則篩選的陽性克隆接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)中振蕩培養(yǎng)后,取2 mL重組菌液,用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽取試劑盒抽提質(zhì)粒,PCR后拍照鑒定,取經(jīng)鑒定的重組菌液1 mL送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行核苷酸序列測定。

    1.6 藥敏試驗按常規(guī)藥敏紙片法測定2株分離菌株對頭孢噻肟、丁胺卡那霉素等18種抗生素的敏感性。敏感度根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)菌落較小,呈圓形、透明、邊緣光滑、奶油狀,取純培養(yǎng)菌做菌液,經(jīng)涂片固定,做革蘭染色,在油鏡下觀察到紅色陰性小桿菌,單個或成對,少數(shù)呈絲狀,無芽孢。

    2.2 生化試驗鑒定兩株分離菌株不發(fā)酵糖類和醇類,不產(chǎn)生硫化氫,尿素酶和過氧化氫酶試驗陽性(見表1)。因此,根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)和生化特性可初步確定為RA。

    2.3 病鵝腦部分離菌株16s rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果病鵝腦部兩株分離菌株以16s rRNA設(shè)計引物時PCR擴(kuò)增得都1條680 bp的特異性條帶(見圖

    1),與預(yù)期結(jié)果相符。

    表1 鴨疫里默菌分離菌株生化試驗結(jié)果

    2.4 目的基因克隆及重組質(zhì)粒鑒定經(jīng)鑒定陽性的菌株進(jìn)行增菌培養(yǎng),用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽取試劑盒抽取質(zhì)粒DNA,經(jīng)PCR鑒定,電泳檢測,結(jié)果與預(yù)期一致(見圖2)。

    圖1 PCR檢測結(jié)果

    2.5 序列測定及分析2株RA重組質(zhì)粒樣品測序后經(jīng)BLAST進(jìn)行序列分析,測序結(jié)果與Gen?Bank中收錄的鴨疫里默菌基因序列進(jìn)行比對,進(jìn)一步證實為鴨疫里默菌序列。

    圖2 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

    2.6 藥敏試驗結(jié)果兩株細(xì)菌(AH1、AH2)藥敏試驗結(jié)果為,AH1對頭孢噻肟鈉、硫酸丁胺卡那霉素高敏;對阿奇霉素中敏;AH2對強(qiáng)力霉素、壯觀霉素高敏;對左氧氟沙星、新霉素中敏;而兩株對氟苯尼考、慶大霉素、氨芐西林、潔霉素、鏈霉素、阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、磷霉素、環(huán)丙沙星、羅美沙星、利福平等藥物均不敏感。

    3 討論

    3.1 對RA感染進(jìn)行準(zhǔn)確診斷必需依靠細(xì)菌的分離和鑒定。鑒定RA通常檢測其培養(yǎng)特性、染色反應(yīng)、生理生化特征、菌體的某些化學(xué)組成等表型指標(biāo),但RA常缺乏特定的表型特征和選擇性的培養(yǎng)基[6],僅依據(jù)表型卻不足以對RA做出準(zhǔn)確鑒定。因此,使用分子方法進(jìn)行鑒定十分必要。本試驗通過細(xì)菌分離、生理生化鑒定、16S rRNA分析,將生理生化特性測定與16S rRNA序列分析鑒定相結(jié)合,使鑒定結(jié)果更科學(xué)、更準(zhǔn)確。

    3.2 由于細(xì)菌的16S rRNA基因分子結(jié)構(gòu)上的高度保守性,因此常用于對細(xì)菌的種屬鑒定[7-9]。本試驗通過對2株鵝源RA安徽流行株的16S rRNA基因擴(kuò)增和序列分析,鑒定其是否屬于鴨疫里默氏菌,所得到的序列通過比對,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與GenBank上發(fā)布的RA的16S rRNA的同源性達(dá)到99.98%。

    3.3 藥物敏感性試驗中,2株鵝源里默菌對相同藥物的敏感性不盡相同,與其他報道也不盡相同[10],說明不同鴨群RA的分離株對同種藥物表現(xiàn)出差異,藥敏試驗對臨床用藥治療RA感染具有重要的意義。目前由于濫用抗菌類藥物而導(dǎo)致耐藥性日益嚴(yán)重,因此鵝場感染RA后,最好根據(jù)RA的藥敏試驗來進(jìn)行治療,避免因藥物耐藥性而造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。

    [1]胡清海,劉曉文,苗晉鋒,等.一株鵝源鴨疫里氏桿菌與鴨源分離株的致病性比較[J].畜牧與獸醫(yī),2002,34(9):3-4.

    [2]趙寶華,徐步,范建華.鵝源鴨疫里默氏桿菌的分離和鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37(8):189-192.

    [3]呂敏娜,戚南山,覃宗華,等.鵝源鴨疫里默氏桿菌的分離、鑒定與生物學(xué)特性研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2012,39(12):1755-1761.

    [4]馮金牛,阮二壘,楊麗云,等.鴨疫里默氏桿菌的分離與16S rRNA的鑒定[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,31(6):73-76.

    [5]J薩姆布魯克,DW拉塞爾.分子克隆實驗指南[M].3版.黃培堂譯.北京:科學(xué)出版社,2005:1130-1132.

    [6]Tsai H J,Liu Y,Tseng C S,et al.Genet ic variation of the ompA and 16S rRNA genes of Riemerella anatipestifer[J].Avian Patholo?gy,2005,34(1):55-64.

    [7]謝永福,陳芳艷,馮金牛,等.鴨疫里默氏桿菌巢式PCR檢測方法的建立[J].中國家禽,2013,35(9):19-22.

    [8]李春芬,李郁,魏建忠,等.安徽省部分地區(qū)鴨疫里氏桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2009,31(3):197-200.

    [9]曲豐發(fā),蔡暢,鄭獻(xiàn)進(jìn),等.利用16S rDNA建立種特異性PCR快速檢測鴨疫里默氏菌[J].微生物學(xué)報,2006,46(1):13-17.

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    S852.612

    B

    0529-6005(2015)12-0048-02

    2015-02-12

    國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-41);安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊項目(11C0404);國家自然科學(xué)基金項目(31302044)

    胡曉苗(1971-),男,助理研究員,碩士,主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究,E-mail:huxiaomiao66@163.com

    戴銀,E-mail:daiyin2020@163.com

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