實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒方法的建立及應(yīng)用

方振華，丁 利

（1.海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，海南?？?70216；2.海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，海南?？?71158）

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒方法的建立及應(yīng)用

方振華1，丁 利2

（1.海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，海南?？?70216；2.海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，海南?？?71158）

本研究將豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）N基因部分片段克隆并連接到pGEM-T Easy載體上，得到重組質(zhì)粒，以此為標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR擴(kuò)增并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立TGEV的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)10拷貝/μL，具有良好的特異性和重復(fù)性；對(duì)20份臨床疑似病料進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)14份為熒光定量RT-PCR陽(yáng)性，而常規(guī)RT-PCR只能檢測(cè)出10份。結(jié)果表明，建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法具有特異、敏感、快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床TGEV感染的早期診斷以及分子流行病學(xué)調(diào)查。

豬傳染性胃腸炎病毒；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR；SYBRGreen I

豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis of swine，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的一種高度接觸性傳染病，以嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水以及致兩周齡內(nèi)仔豬高死亡率為主要臨床特征，是我國(guó)法定重點(diǎn)防控的疫病之一。隨著中國(guó)集約化養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的程度愈來愈高，TGE的發(fā)生與流行有明顯加重的趨勢(shì)，且與其他病原混合感染和繼發(fā)感染已成為當(dāng)今豬群發(fā)病的普遍規(guī)律，導(dǎo)致臨床診斷難度大大增加，因此研究特異靈敏的診斷方法對(duì)快速檢測(cè)及防治TGE具有十分重要的意義。目前，常規(guī)檢測(cè)TGEV的方法大部分操作繁瑣，且靈敏度不高［1-2］，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便快捷等特點(diǎn)，且可以有效防止檢測(cè)過程中的污染及假陽(yáng)性，可大大提高檢測(cè)效率［3］。本研究以TGEV N基因序列為靶基因，建立一種特異的實(shí)時(shí)定量PCR方法，用于TGEV的實(shí)時(shí)檢測(cè)，該法快速、靈敏、準(zhǔn)確，從而為TGEV的早期快速診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒三聯(lián)苗，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；豬傳染性胃腸炎病毒、豬乙型腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、PK-15細(xì)胞、大腸桿菌DH5α均由本實(shí)驗(yàn)室保存；TGEV臨床檢測(cè)病料來自各地市自然感染豬。

1.2 主要試劑T載體、Taq DNA聚合酶、dNTP等均為Fermentas公司產(chǎn)品；DNA凝膠快速回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為Vigorous公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；2× SYBRGreen-IMasterMix為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，其他常規(guī)試劑均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Gen Bank公布的TGEV N基因序列，設(shè)計(jì)N基因引物，由南京金斯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。序列為上游引物：5′-ACAAACACACCTGGAAGAGAACT-3′；下游引物：5′-GAATGCTAGACACAGATGGAACAC-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段165 bp。

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板的制備病毒總RNA提取按TRIZol試劑說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)后的cDNA用于目的基因片段的擴(kuò)增，然后將目的片段與pGEM-T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。經(jīng)驗(yàn)證陽(yáng)性的重組質(zhì)粒，測(cè)定質(zhì)粒模板濃度，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，然后將其10倍倍比稀釋作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增用標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行SYBRGreenⅠ熒光定量PCR擴(kuò)增。分別對(duì)反應(yīng)體系中的引物濃度、退火溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化，通過預(yù)試驗(yàn)對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，并利用Bio-Rad iQ5軟件進(jìn)行分析，得到擴(kuò)增曲線、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性、重復(fù)性和敏感性試驗(yàn)將豬輪狀病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬乙型腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒樣品的cDNA或DNA，按照優(yōu)化的條件進(jìn)行熒光定量PCR，驗(yàn)證其特異性、重復(fù)性和敏感性。

1.8 臨床樣品的檢測(cè)對(duì)各地市送檢的20份臨床病料進(jìn)行處理，提取RNA，應(yīng)用普通RT-PCR方法和熒光定量PCR方法檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 普通PCR結(jié)果與測(cè)序分析以TGEV N基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行普通RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定，與預(yù)期結(jié)果一致。將目的片段回收、純化、克隆到pGEM-TEasy載體（簡(jiǎn)稱pGEM-T-N），質(zhì)粒PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果與TGEV相應(yīng)區(qū)域100%同源。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件的優(yōu)化對(duì)TGEV SYBR GreenⅠ熒光定量PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定如下：反應(yīng)總體系為25μL，2×SYBRGreen-IMaster Mix 12.5μL，上、下游引物各0.5μL（20μmo l/L），模板1μL，滅菌去離子水10.5μL。循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性10min；95℃5 s，60℃30 s。40個(gè)循環(huán)數(shù)，在該條件下擴(kuò)增曲線起跳早，熒光值較高，溶解曲線峰狹窄單一。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將標(biāo)準(zhǔn)樣品10倍倍比稀釋，并分別以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。從圖1可知，在溶解曲線上有單一的峰，說明本方法特異性高。經(jīng)IQ5熒光定量PCR儀軟件繪制質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），由結(jié)果可知斜率為R2=0.998，擴(kuò)增效率為100.2%。說明在稀釋的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 TGEV熒光定量RT-PCR溶解曲線

圖2 TGEV熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 熒光定量PCR的特異性、重復(fù)性和敏感性試驗(yàn)將TGEV、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒、豬乙型腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒的模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除TGEV能夠擴(kuò)增出S型曲線外，其他對(duì)照病毒均不能檢測(cè)出S型曲線，表明所建立的方法具有較強(qiáng)的特異性（圖3）。選取同一稀釋倍數(shù)的重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。由圖4可知，同一濃度所得的Ct值基本相同，變異很小，表明此方法的重復(fù)性良好。將模板質(zhì)粒稀釋成濃度為101，102，103，104，105，106，107，108，109的標(biāo)準(zhǔn)品，并分別以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，由擴(kuò)增曲線可知其靈敏度為10拷貝/μL（圖5）。

圖3 TGEV熒光定量RT-PCR特異性試驗(yàn)

圖4 TGEV熒光定量RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)

圖5 TGEV熒光定量RT-PCR敏感性試驗(yàn)

2.5 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果比較對(duì)20份臨床病料應(yīng)用所建立的熒光定量RT-PCR方法和普通RTPCR方法同時(shí)檢測(cè)，設(shè)置陽(yáng)性病料2份和陰性病料2份作為對(duì)照。結(jié)果顯示，用常規(guī)RT-PCR檢出10份TGEV陽(yáng)性病料，而熒光定量PCR檢出14份陽(yáng)性病料，熒光定量PCR檢測(cè)靈敏度高于常規(guī)RT-PCR。

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種新型的核酸定量技術(shù)，由于其靈敏度高、重復(fù)性好、污染少等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)、基因表達(dá)研究、病原體檢測(cè)、病毒荷載量測(cè)定等方面［6］。常用的PCR定量方法主要包括SYBRGreen I染料法、Taq Man探針法、分子信標(biāo)法、雜交探針法等［4］。SYBR Green I熒光定量PCR方法只需在SYBR Green I反應(yīng)混合液中加入引物和待測(cè)樣品，其成本相對(duì)低廉。與Taq Man探針法相比，更加簡(jiǎn)便，無需合成價(jià)格昂貴的探針［5］。該技術(shù)應(yīng)用于TGEV檢測(cè)，能在病毒隱性感染和豬發(fā)病早期進(jìn)行快速確診和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。部分學(xué)者利用TGEV基因序列設(shè)計(jì)合成引物和探針，建立了Taq Man熒光定量RT-PCR方法，其檢測(cè)敏感性比常規(guī)RT-PCR方法提高了多倍［6-7］。張?jiān)啤⑼踅ㄖ械妊芯空哚槍?duì)TGEV的S基因等建立了SYBRGreen I熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好［8-10］。本試驗(yàn)建立的TGEV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法靈敏度可達(dá)10拷貝/μL，與豬輪狀病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬乙型腦炎病病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。與普通RT-PCR相比，SYBRGreen IPCR的擴(kuò)增和檢測(cè)都在同一管內(nèi)完成，不需要后續(xù)的電泳檢測(cè)，有效解決了污染問題，而且操作更簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間更短，可作為規(guī)?；i場(chǎng)TGEV的凈化檢測(cè)方法，同時(shí)也可用于臨床TGEV感染的早期診斷以及分子流行病學(xué)調(diào)查。

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Development of real-time RT-PCR for detecting transm issible gastroenteritisvirus and its prelim inary application

FANG Zhen-hua1，DING Li2
（1.School of Biological Engineering，Hainan College of Vocation and Technique，Haikou 570216，China；2.College of Life Sciences，Hainan Normal University，Haikou 571158，China）

Transmissible gastroenteritis virus（TGEV）N genewas cloned into pGEM-TEasy vector，which is used as the standard template for real-time RT-PCR.Then，the standard curvewasmade，and the real-time RT-PCRmethod was established for TGEV detection.The sensitivity of themethod could reach 10 copies/μLwith good specificity and repeatability.20 samples from sick pigswere tested，ofwhich 14 were positive by real-time RT-PCR detection，while only 10 were tested positive by conventional RT-PCR.These results showed that the real-time RT-PCRmethod was specific，sensitive，rapid and good repeatability.Thus，Thismethod established RT-PCR can be used for the early diagnosis of TGEV infection andmolecular epidemiological investigation.

transmissible gastroenteritis virus；real-time RT-PCR；SYBR GreenⅠ

DING Li

S852.65+1

A

0529-6005（2015）12-0020-03

2014-07-14

國(guó)家自然科學(xué)基金（31502036）；海南省自然科學(xué)基金（314076；20153086）

方振華（1980-），男，講師，碩士，從事動(dòng)物飼養(yǎng)管理及疾病防治教學(xué)和科研工作，E-mail：okay1688@163.com

丁利，E-mail：dingli705@163.com