牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原間接ELISA診斷方法的建立

侯美如，高俊峰，周慶民，侯喜林

（1.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾161006；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319）

牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原間接ELISA診斷方法的建立

侯美如1，高俊峰1，周慶民1，侯喜林2

（1.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾161006；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319）

以純化的原核表達(dá)的牛輪狀病毒VP7蛋白為包被抗原，建立了檢測(cè)牛輪狀病毒抗體的間接ELISA診斷方法。特異性試驗(yàn)表明，該抗原與其他5種常見牛病病毒（IBRV、BCV、BRSV、ETEC、Cj）的陽性血清無交叉反應(yīng)，板內(nèi)和板間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%；對(duì)來自不同牛場(chǎng)的血清樣本檢測(cè)結(jié)果顯示，該檢測(cè)方法與病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)87.2%。本試驗(yàn)建立的ELISA診斷方法具有良好的重復(fù)性、敏感性和特異性，為BRV的快速診斷、免疫牛群血清抗體監(jiān)測(cè)及輪狀病毒流行病學(xué)調(diào)查提供了一種快速、簡便的血清學(xué)診斷方法。

牛輪狀病毒；重組VP7蛋白；間接ELISA；診斷

輪狀病毒（Rotavirus，RV）為呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬（Rotavirus），是各種幼齡動(dòng)物非細(xì)菌性腹瀉的主要病原之一。于1968年美國Mebus［1］等首次用電鏡從犢牛腹瀉糞便中分離出牛輪狀病毒，命名為NCDV株（Nebraska calf diarrhea Virus，NCDV）。牛輪狀病毒可引起動(dòng)物精神沉郁、水樣腹瀉、酸中毒以及食欲廢絕，多發(fā)于15～45日齡犢牛，是引起犢牛腹瀉最重要的病原之一，約50%新生犢牛腹瀉是因該病毒感染引起［2］，嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)的發(fā)展。

目前檢測(cè)牛輪狀病毒的方法有RT-PCR、病毒分離鑒定、病毒中和試驗(yàn)等，但因操作復(fù)雜、技術(shù)要求高、儀器昂貴等因素，而很難在臨床大規(guī)

模應(yīng)用。本試驗(yàn)以純化的原核表達(dá)牛輪狀病毒VP7蛋白為包被抗原，采用方陣法初步建立檢測(cè)牛輪狀病毒抗體的間接ELISA診斷方法，旨為牛輪狀病毒病臨床的大規(guī)模流行病學(xué)及綜合防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料病毒、血清及細(xì)胞BRV-DQ株分離自黑龍江省大慶地區(qū)某奶牛場(chǎng)；試驗(yàn)中所應(yīng)用的牛輪狀病毒陰、陽性血清均由本實(shí)驗(yàn)室制備保存；MA104（恒河猴胎腎傳代細(xì)胞系）由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG的酶標(biāo)二抗，購自Sigma公司；四甲基聯(lián)苯胺（TMB），購自Bioshop公司；胰酶、胎牛血清和DMEM液體培養(yǎng)基，購自GIBCO公司；96孔酶標(biāo)板，購自美國CORNING公司；其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 包被抗原抗原為牛輪狀病毒DQ株，經(jīng)克隆、表達(dá)所得的包括5個(gè)抗原表位在內(nèi)的BRVVP7融合蛋白（專利申請(qǐng)中）。將重組菌放于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm值為0.6～1.0 h，加入終濃度為1 mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)4 h，10 000 r/min離心3min收集菌體，用電洗脫方法進(jìn)行蛋白純化。

1.4 重組VP7蛋白間接ELISA檢測(cè)方法的建立

1.4.1 間接ELISA方法工作條件的確立（1）抗原最適包被濃度和血清最佳稀釋度的確定：按方陣滴定法［3］，用碳酸鹽包被液將純化后的重組蛋白（2.40mg/mL）依次作1∶600（4.0μg/mL），1∶1 200（2.0μg/mL），1∶2 400（1.0μg/mL），1∶4 800（0.5μg/ mL），1∶9 600（0.25μg/mL）稀釋，每孔100μL包被ELISA板，4℃過夜。陽性血清和陰性血清都作1∶100，1∶200，1∶400，1∶800稀釋，兔抗牛IgG酶標(biāo)二抗作1∶5 000稀釋，依照間接ELISA程序操作，OD450nm值用酶標(biāo)儀讀取。選取陽性O(shè)D450nm值＞1，陰性O(shè)D450nm值＜0.2，P/N值最大時(shí)的抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)為最佳工作濃度；（2）封閉液及封閉時(shí)間的選擇：用最適抗原濃度37℃包被2 h，封閉液分別選擇1%明膠、5%脫脂乳、1%BSA、10%胎牛血清的PBST進(jìn)行封閉，同時(shí)做不封閉對(duì)照組，37℃封閉1 h，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，選擇最佳封閉液。用最佳包被抗原濃度、最佳血清稀釋度、最佳封閉液進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，分別封閉0.5、1、1.5、2 h，測(cè)定其OD450nm值，選取P/N值最大時(shí)為最佳封閉時(shí)間；（3）血清最適作用時(shí)間的確定：用最適抗原濃度37℃包被2 h，以最適封閉液封閉，將陰、陽性血清稀釋至最佳濃度，在37℃分別作用0.5、1、1.5、2 h，依照間接ELISA程序操作，測(cè)定其OD450nm值，選取P/N值最大時(shí)為血清最適作用時(shí)間；（4）酶標(biāo)二抗工作濃度的選擇：用最適抗原濃度37℃包被2 h，以最適封閉液封閉，最適稀釋度稀釋血清，兔抗牛IgG酶標(biāo)二抗作1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000稀釋，依照間接ELISA程序操作，測(cè)定其OD450nm值，選取P/N值最大時(shí)為最佳的酶標(biāo)二抗工作濃度。

1.4.2 判定臨界值的確定運(yùn)用建立的ELISA方法分別對(duì)47份經(jīng)病毒中和試驗(yàn)為陰性的血清進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定其OD450nm值，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算出47份陰性血清的平均OD450nm值（X）及其標(biāo)準(zhǔn)方差（S），確定該方法的陰陽性臨界值（X+3S），即當(dāng)檢測(cè)樣本OD450nm值≥X+3S時(shí)，可判定為陽性，否則為陰性。

1.4.3 特異性試驗(yàn)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的牛呼吸道合胞體（BRSV）、牛冠狀病毒（BCV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）以及產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）、空腸彎曲桿菌（Cj）的陽性血清作為待檢樣品，同時(shí)設(shè)BRV標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清作為對(duì)照，每種樣品做2個(gè)重復(fù)，按照間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)判定有無交叉反應(yīng)。

1.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)在同一塊酶標(biāo)板內(nèi)及不同酶標(biāo)板間檢測(cè)5份不同抗原水平的樣本，每份樣品重復(fù)4孔，按最佳條件進(jìn)行ELISA檢測(cè)。計(jì)算同一份樣品OD450nm值的變異系數(shù)（CV），以檢驗(yàn)板內(nèi)、板間檢測(cè)樣品的重復(fù)性。

1.4.5 符合性試驗(yàn)運(yùn)用建立的間接ELISA檢測(cè)方法與病毒中和試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)78份牛血清樣本，將兩種檢測(cè)方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較分析，結(jié)果一致的血清樣本總數(shù)占總體樣本數(shù)的比例為符合率。

2 結(jié)果

2.1 BRV VP7-ELISA最佳反應(yīng)條件的確定結(jié)果

通過方陣滴定法確定抗原最佳包被濃度為0.25μg/mL，血清稀釋度為1∶100，酶標(biāo)二抗作1∶5 000稀釋，5%脫脂乳于37℃封閉1 h，血清作用時(shí)間1.5 h，酶標(biāo)二抗作用1 h，試驗(yàn)結(jié)果最好。

2.2 間接ELISA方法判定臨界值的確定經(jīng)中和試驗(yàn)證實(shí)為BRV抗體陰性牛血清47份，運(yùn)用建立的間接ELISA方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出47份陰性血清的平均OD450nm值（X）為0.09，標(biāo)準(zhǔn)差（S）為0.047，陰性和陽性對(duì)照成立的情況下，確定該方法陰陽性臨界值（X+3S）為0.231，若血清樣本OD450nm值≥0.231時(shí)，判為陽性；OD450nm值＜0.231時(shí)判為陰性。

2.3 特異性試驗(yàn)由圖1可見，BRV VP7蛋白抗原只與BRV陽性血清反應(yīng)，與其他5種牛病的陽性血清的OD450nm值均小于0.231，無交叉反應(yīng)性，表明本試驗(yàn)所建立的間接ELISA方法的特異性較高。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)（1）板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：在同一塊酶標(biāo)板上檢測(cè)5份不同抗體水平的血清樣品，重復(fù)性分析結(jié)果見表1，其變異系數(shù)在2.95%～6.23%之間，變異程度很小，具有較好的重復(fù)性；（2）板間重復(fù)性試驗(yàn)：同一份血清樣品在4塊不同板上進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，結(jié)果見表2，其變異系數(shù)在4.72%～7.52%之間，小于10%，說明板間的變異程度很小，具有較好的重復(fù)性。

圖1 間接ELISA特異性試驗(yàn)

表1 板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

表2 板間重復(fù)性試驗(yàn)

2.5 符合性試驗(yàn)利用本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法與病毒中和試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)78份牛血清，檢測(cè)結(jié)果見表3，所檢血清ELISA陽性為47份，陰性31份；中和試驗(yàn)陽性41份，陰性37份。VP7蛋白ELISA方法與病毒中和試驗(yàn)的符合率達(dá)87.2%。

表3 重組VP7蛋白ELISA方法與VN試驗(yàn)的比較

3 討論

輪狀病毒可引起人及各種幼畜腹瀉，仔豬和犢牛感染尤為普遍，給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大危害，該病的臨床表現(xiàn)常與其他細(xì)菌病、病毒病相混淆，難以鑒別，能夠準(zhǔn)確的診斷該病對(duì)本病臨床防治具有重大意義。

自1971年Engval和Weemen建立ELISA方法，因其操作簡便、判斷可觀、特異性及敏感性強(qiáng)等特點(diǎn)，被廣泛用于臨床疾病的檢測(cè)［4］。本試驗(yàn)運(yùn)用方陣滴定法對(duì)ELISA方法進(jìn)行條件優(yōu)化，建立一種簡便、快捷的牛輪狀病毒血清學(xué)診斷手段。

牛輪狀病毒VP7蛋白為該病毒的外衣殼蛋白，其蛋白含量位居病毒結(jié)構(gòu)蛋白第二位，占輪狀病毒蛋白總量的30%，由輪狀病毒第9（或7、8，依不同毒株而異）基因節(jié)段編碼，共326個(gè)氨基酸組成，分子量達(dá)37 kDa，是輪狀病毒的主要中和抗原，決定其G血清型［5］。本試驗(yàn)以重組構(gòu)建的BRV-VP7蛋白為包被抗原，利于大規(guī)模生產(chǎn)的要求，較以病毒為包被抗原的ELISA方法，其生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)出大，減少散毒風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)環(huán)境有好處。適于實(shí)驗(yàn)室及基層臨床大規(guī)模使用，為無特效藥治療的牛輪狀病毒提供了一種更為科學(xué)合理便捷的診斷方法，對(duì)該病的臨床防治及科學(xué)的免疫預(yù)防提供了前提和基礎(chǔ)。

本研究確定了牛輪狀病毒間接ELISA方法檢測(cè)的最佳工作條件和判定標(biāo)準(zhǔn)，即抗原最適包被濃度為0.25μg/mL，血清最適稀釋度為1∶100，封閉液為5%脫脂奶粉，最佳封閉時(shí)間和血清最適作用時(shí)間分別為1 h、1.5 h，最佳二抗工作濃度為1∶5 000。血清樣本OD450nm值≥0.231時(shí)，判為陽性；OD450nm值＜0.231時(shí)判為陰性。

變異系數(shù)能夠衡量資料中各觀測(cè)值變異程度，反應(yīng)觀測(cè)值在單位均值上的離散程度［6］。本方法板內(nèi)、板間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于10%，表明該方法結(jié)果重現(xiàn)性好。與其他5種牛病病毒陽性血清無交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)。與病毒中和試驗(yàn)符合率達(dá)87.2%，準(zhǔn)確性良好。本試驗(yàn)建立的牛輪狀病毒診斷方法具有重現(xiàn)性好、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、操作簡單等特點(diǎn)，為該病毒病的ELISA診斷試劑盒的最終組裝提供了試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

［1］Mebus C A，Unerdahl N R.Further studies on neonatal calf diar?rhea virus［J］.Proc Annu Meet US Anim health Assoc，1969，73：97-99.

［2］殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，1997：562-571.

［3］董華興，侯喜林，謝金鑫，等.牛傳染性鼻氣管炎DQ株gD基因表達(dá)及其間接ELISA方法的建立［J］.中國獸醫(yī)雜志，2011，47（2）：3-5.

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Development of an indirect ELISA for detection antibodies to bovine rotavirus using recombinant VP7 antigen

HOUMei-ru1，GAO Jun-feng1，ZHOUQing-min1，HOU Xi-lin2
（1.Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihar 161006，China；2.College of Animal Science
and Veterinary Medicine，Heilongjiang BAY1 Agriculture university，Daqing 163319，China）

An indirect ELISA was developed to detect antibody against BRV using the recombinant protein from the epitopes region of VP7 protein.The recombinant VP7 protein antigen showed no cross-reaction with the positive sera of other five diseases（IBRV，BCV，BRSV，ETEC and Cj）.The established method showed 87.2%concordance with neutralization test.Itwas specific and sensitive，and could be used as a simple and rapid approach formonitoring of anti-BRV antibody and epidemiologic survey of BRV.

Bovine rotavirus；recombinant VP7 protein antigen；indirect ELISA；diagnosis

HOU Xi-lin

S852.65+3

A

0529-6005（2015）12-0017-03

2014-07-23

侯美如（1985-），女，碩士，從事奶牛疾病研究，E-mail：houmeiru168@126.com

侯喜林，E-mail：xly-hou@yahoo.com.cn