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    水中白骨化尸體的DNA檢驗

    2015-04-17 09:58:45張自雄胡麗梅向峰鄒軍根
    法醫(yī)學(xué)雜志 2015年2期
    關(guān)鍵詞:長骨白骨膜法

    張自雄,胡麗梅,向峰,鄒軍根

    (巴中市公安局物證鑒定所,四川巴中 636000)

    ·經(jīng)驗交流·

    水中白骨化尸體的DNA檢驗

    張自雄,胡麗梅,向峰,鄒軍根

    (巴中市公安局物證鑒定所,四川巴中 636000)

    法醫(yī)遺傳學(xué);磁珠法;硅膜法;股骨;牙齒

    白骨化尸體的身源鑒定往往是法醫(yī)學(xué)鑒定的難點之一。通常選用長骨、牙齒作為檢材,然而對于水中浸泡的白骨化尸體則增加了DNA檢驗的難度,如何建立穩(wěn)定、有效的檢驗方法具有重要意義。本研究就本實驗室近年來對在水中浸泡后形成的50例白骨化尸體的DNA檢驗,總結(jié)經(jīng)驗,介紹如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    各類案件發(fā)現(xiàn)的水中白骨化尸體50例,共取得股骨50根、牙齒50枚。

    1.2 方法

    1.2.1 預(yù)處理

    取股骨干一段,沙紙反復(fù)擦拭去除表面污垢,5%次氯酸鈉溶液清洗表面,蒸餾水清洗3~6次,無水乙醇沖洗一次,晾干,最后紫外光照射。

    取送檢牙齒,用蒸餾水浸泡清洗表面,并用棉簽、刀片等除去牙齒表層污垢,加入5%次氯酸鈉浸泡10min左右,棄廢液,蒸餾水泡洗3~5次,95%乙醇溶液浸泡1 h,用濾紙吸干,以紫外線消毒牙齒各面各15min。

    1.2.2 裂解

    將牙齒用簡易砸牙器砸成牙齒粉末,用電鉆鉆取股骨干部位制成骨粉,分別置于1.5mL離心管中,加入0.5mol/L脫鈣液(EDTA),振蕩后放于37℃水浴箱脫鈣24h,隔12h離心,更換EDTA。脫鈣完成后,以離心半徑5cm,13000r/min,離心5min,棄去上清液,牙齒粉末中加入300 μL骨骼裂解液、30 μL DTT溶液(1 mol/L)以及30 μL PK溶液(20 mg/μL),56℃消化12 h,消化完全后,以離心半徑5 cm,13 000 r/min,離心5min,將上清液移至新1.5mL離心管中進(jìn)行純化。

    1.2.3 純化

    取以上上清液各一半分別采用硅膜法(QIAquick純化試劑盒,德國QIAGEN公司)和磁珠法(DNA IQ試劑盒,美國Promega公司)試劑進(jìn)行DNA純化。

    硅膜法純化步驟:(1)將上清液與體積相同的V氯仿/V異戊醇=24∶1混勻,以離心半徑5cm,13000r/min,離心5min,吸取上層水相至5mL試管中。(2)用純化試劑盒中的PBI試劑與上清液按5∶1體積振蕩混勻,然后向純化柱中加入適量混合液,以離心半徑5cm,13000r/min,離心1min,重復(fù)操作直到混合液全部過濾。(3)加300μL PBI試劑離心并洗滌1次,加入已配制的洗滌液(PE),離心并洗滌3次,再以離心半徑5 cm,13 000 r/min,離心1 min,將純化柱放到新的1.5mL微量離心管上,打開蓋子于室溫中揮發(fā)5min。(4)將洗脫液(EB)20 μL加入純化柱的硅膜中心,65℃恒溫5 min,以離心半徑5 cm,13 000 r/min,離心1 min,收集微量離心管內(nèi)液體用于PCR反應(yīng)或置于4℃,保存?zhèn)溆谩?/p>

    磁珠法純化步驟:(1)取適量液體樣品放入1.5mL離心管中,加入2倍體積配制好的裂解液(內(nèi)含1μL 1mol/L DTT)和7μL磁珠,旋渦振蕩使磁珠懸浮,室溫放置5min。(2)旋渦振蕩后將離心管放在磁架上,小心吸去液體。(3)用100μL裂解液洗滌一次,旋渦振蕩使磁珠懸浮,將離心管放在磁架上,小心吸去液體。(4)用100μL洗液洗滌3次,每次旋渦振蕩使磁珠充分懸浮。(5)打開離心管蓋,室溫下空氣干燥5~10min。(6)加入30μL的EB洗脫液,蓋好蓋子,65℃加熱5min。(7)從水浴中取出離心管,立即用旋渦振蕩器振蕩離心管,待磁珠懸浮后,立即將離心管放回磁架上。(8)小心將DNA溶液吸到干凈離心管中用于PCR擴(kuò)增或置于4℃冰箱保存。

    1.2.4 PCR擴(kuò)增和電泳檢測

    采用Identifiler試劑盒(美國AB公司)擴(kuò)增,操作按照儀器及試劑使用說明書進(jìn)行。

    擴(kuò)增后用3130XL遺傳分析儀(美國AB公司)進(jìn)行電泳檢測,GeneMapper v3.2軟件分析結(jié)果。

    2 結(jié)果與討論

    在50例送檢檢材中,對股骨采用硅膜法純化獲得STR分型46例,采用磁珠法純化獲得STR分型42例。牙齒采用硅膜法純化獲得STR分型50例,采用磁珠法純化獲得STR分型47例。經(jīng)與失蹤人員親屬DNA STR分型比對,均符合生物學(xué)遺傳關(guān)系。

    通過對水中白骨化尸體長骨、牙齒的DNA檢驗,筆者認(rèn)為牙齒DNA檢驗效果優(yōu)于長骨。雖然牙齒和長骨內(nèi)的DNA分子保存均較長,但是牙齒有3種堅硬的礦化組織保護(hù),因此對于時間和外界環(huán)境(如水)有較強(qiáng)抵抗力,而長骨正是缺少這樣一種特殊的保護(hù),其DNA分子往往受到破壞而降解。因此條件允許的情況下,對于白骨化尸體,DNA檢驗時選擇牙齒檢材要優(yōu)于長骨。同時選擇的牙齒要保證其完整性,優(yōu)先選擇磨牙。在選擇純化試劑盒的方面,本實驗室在純化過程中分別采用了磁珠純化法和硅膜純化法進(jìn)行結(jié)果比較,發(fā)現(xiàn)硅膜法純化法優(yōu)于磁珠純化法,分析其原因可能為硅膜可通過控制孔徑選擇性地濾過DNA分子,達(dá)到最佳純化目的。

    DF795.2

    B

    10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.017

    1004-5619(2015)02-0147-01

    2014-09-24)

    (本文編輯:李成濤)

    張自雄(1979—),男,四川巴中人,主檢法醫(yī)師,主

    要從事法醫(yī)物證學(xué)檢驗工作;E-mail:37788913@qq.com

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