冬蟲夏草菌人工培養(yǎng)研究進(jìn)展

黃寶菊，王 忠，李 菲，黃雪峰，鄭方毅

［安發(fā)(福建)生物科技有限公司 352100］

冬蟲夏草是真菌界子囊菌綱肉座菌目麥角菌科冬蟲夏草屬的冬蟲夏草菌，冬蟲夏草為冬蟲夏草屬冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾幼蟲上的具有成熟子囊殼的子座及蝙蝠蛾幼蟲尸體的復(fù)合體［1］，是國家Ⅱ級保護(hù)物種［2］，其藥性溫和，老、少、病、弱、虛者皆宜，可以降低血液中的膽固醇和甘油三酯，提高對人體有利的高密度蛋白，減輕動脈粥樣硬化。冬蟲夏草還具有直接抗病毒、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能和調(diào)節(jié)性功能等作用。入肺、腎二經(jīng)，甘溫不燥，能滋肺補(bǔ)精益氣，具有補(bǔ)虛損、抗癌癥、抗衰老，增強(qiáng)人體免疫功能的作用。

野生冬蟲夏草生長周期長達(dá)數(shù)年，且近年來對野生冬蟲夏草的濫挖濫采已嚴(yán)重破壞草原生態(tài)環(huán)境或造成野生冬蟲夏草瀕臨滅絕。因此，人工栽培冬蟲夏草成為必然趨勢。我國從20世紀(jì)70年代末開始陸續(xù)對冬蟲夏草菌進(jìn)行人工栽培，冬蟲夏草菌的固體培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)已被廣泛研究。隨著冬蟲夏草菌的深入研究，冬蟲夏草菌周期短，繁殖速度快;李增智等對部分冬蟲夏草菌進(jìn)行了分子生物學(xué)上的基因組DNA指紋圖譜檢測，發(fā)現(xiàn)其與野生冬蟲夏草的相似度高達(dá)96%［3］;發(fā)酵菌絲體與野生冬蟲夏草含有的化學(xué)成分在含量上稍有差別，但成分總體上基本保持不變［4］，冬蟲夏草菌菌絲體將成為野生冬蟲夏草的最佳替代品。但人工仿生栽培冬蟲夏草，由于寄主蝠蛾生長周期長、易遭受病害侵襲，產(chǎn)量低且生產(chǎn)成本高，難以獲得理想效果，因此其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展仍存在很大的障礙。本文綜述了冬蟲夏草菌的分離純化培養(yǎng)、人工固體培養(yǎng)、人工液體發(fā)酵條件的研究進(jìn)展，為進(jìn)一步深入探究冬蟲夏草菌人工栽培及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供參考。

1 分離純化培養(yǎng)

冬蟲夏草菌可以由子座、菌核和蟲體等組織分離得到。在無菌條件下，將冬蟲夏草進(jìn)行分離，接種于特定培養(yǎng)基中，分離后的菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)，即得到純種冬蟲夏草菌。

王忠等［5］將采集的冬蟲夏草進(jìn)行分離，得到冬蟲夏草菌無性型——中國被毛孢，其菌絲為白色，菌苔灰白色，菌落茸狀、圓形，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲體具有鮮香菇氣味。劉錫琎等［6］對康定收集的冬蟲夏草分為子座、柄和蟲體三部分進(jìn)行分離培養(yǎng)，得出冬蟲夏草菌是一種嗜較低溫度的真菌，15～20℃為其生長適溫，25℃以上則抑制生長。分離純化后，在中心部分出現(xiàn)極為稀疏的白色菌叢，是冬蟲夏草菌的菌絲體和分生孢子。經(jīng)過特殊處理，能夠產(chǎn)生較多的菌絲體和分生孢子，某些特殊培養(yǎng)基上既可產(chǎn)生高達(dá)2～3 cm似蚯蚓糞泥狀的隆起黃褐色子座組織，也可以長出豐茂白色的含分生孢子的菌落。

2 人工固體培養(yǎng)

固體培養(yǎng)是指用固體培養(yǎng)基生產(chǎn)菌種或獲得菌絲體及其代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)方法，具有成本低、過程易控、生長周期較短等優(yōu)點。將冬蟲夏草菌分離純化后得到的純種接種到固體培養(yǎng)基上，生長出冬蟲夏草子實體且具有成熟子囊殼的人工培育，為全人工栽培［7］。冬蟲夏草菌的培養(yǎng)隨著培養(yǎng)基的不同，其培養(yǎng)條件亦有所不同，吳彩琴等［8］以豆粕和米糠為固態(tài)培養(yǎng)基，初步確定了在豆粕∶米糠為1∶2(W/W)的固體培養(yǎng)基上發(fā)酵產(chǎn)生的冬蟲夏草多糖的最佳條件為:接種量20%、溫度26℃、培養(yǎng)基含水量60%、空氣相對濕度60%及培養(yǎng)時間7 d。葛飛等［9］進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)中國被毛孢的正交試驗，結(jié)果表明最佳固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組合為:大米5 g、玉米粉2 g、蟬蛹粉1 g、麩皮2 g;進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)中國被毛孢的單因素試驗，結(jié)果表明最佳固體發(fā)酵條件為:溫度20℃、料水比1∶1.5、料層厚度2 cm、無光照。菌絲體中麥角甾醇優(yōu)化后比優(yōu)化前提高了38.6%。王祥誠等［10］以蕨渣為主要原料，采用正交試驗設(shè)計對產(chǎn)生菌質(zhì)多糖的工藝條件 (基質(zhì)蕨渣比例、基質(zhì)含水量和培養(yǎng)基溫度)進(jìn)行了初步的優(yōu)化，優(yōu)化得出冬蟲夏草菌發(fā)酵生產(chǎn)蕨渣菌質(zhì)多糖的最佳培養(yǎng)條件:蕨渣比例85%、基質(zhì)含水量60%、培養(yǎng)基溫度22℃。

冬蟲夏草菌的培養(yǎng)隨著碳源、氮源的不同，其生長狀況亦存在差異，張安寧等［11］在不同碳源、氮源培養(yǎng)基上以生長面積和生長情況為指標(biāo)，得出中國被毛孢的生長的最適碳源為葡萄糖和蔗糖，最適氮源為蛋白胨、酵母膏和脫脂奶粉。周宇爝等［12］研究不同氮源的培養(yǎng)基對中國被毛孢的生長速度和總生物量的影響，結(jié)果表明氮源對菌絲體生物量的影響依次為:黃粉蟲蛹粉＞牛肉蛋白胨＞黃粉蟲粉＞蛋白胨＞大豆。

綜上所述，冬蟲夏草菌的適宜生長溫度為20～26℃，培養(yǎng)基含水量為60%;適宜的微量元素有利于菌絲體的生長;碳源、氮源對菌絲體均有所影響。目前固體培養(yǎng)以冬蟲夏草菌生長面積和生長情況為指標(biāo)研究最佳條件的試驗居多，以冬蟲夏草菌有效成分為指標(biāo)研究最佳生長條件的研究較少。若在固體培養(yǎng)冬蟲夏草菌有效成分的提高方面進(jìn)行深入研究，將有助于固體培養(yǎng)冬蟲夏草菌在替代冬蟲夏草的研究道路上取得更大突破。

3 人工液體發(fā)酵培養(yǎng)

液體培養(yǎng)是指用液體培養(yǎng)基生產(chǎn)菌種或獲得菌絲體及其代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)方法，具有成本低、發(fā)酵產(chǎn)物易于開發(fā)利用、發(fā)酵過程條件易控、生長周期較固體培養(yǎng)時間更短、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點。從生物學(xué)角度看，蟲草真菌在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵時能夠產(chǎn)生大量有藥用價值、經(jīng)濟(jì)價值的菌絲，保證藥用物質(zhì)的來源并緩解野生冬蟲夏草資源緊張的現(xiàn)狀。

劉欣等［13］對中國被毛孢YS－08－4菌株的液體培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化研究，篩選出中國被毛孢菌YS－08－4菌株優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方為氮源A 60%、H2PO40.23%、氮源 B2%、葡萄糖2.71%。尚德靜等［14］對冬蟲夏草菌的深層培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，明確了冬蟲夏草菌深層發(fā)酵的最適培養(yǎng)條件應(yīng)為溫度24℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、pH值5.0左右，接種量5%～15%，菌絲生長的最佳碳源為葡萄糖、最佳氮源為蛋白和氨基酸復(fù)合粉、最佳無機(jī)鹽為磷酸二氫鉀、硫酸鎂和氯化鈣。張忠廣等［15］對冬蟲夏草菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，篩選最佳培養(yǎng)基組合為土壤浸出液 (1∶1)25 mL、脫脂牛奶25 mL、牛肉蛋白胨1.3 g、無菌水200 mL、葡萄糖3.8 g、磷酸二氫鉀0.18 g、硫酸亞鐵0.1 g。在裝量40%、pH值5.5、溫度18～20℃、搖床轉(zhuǎn)速100～120 r/min、培養(yǎng)96 h條件下，菌絲體產(chǎn)量較高，達(dá)到0.02 g/mL。

李邦良等［16］申請了一種用于生產(chǎn)冬蟲夏草菌絲體的培養(yǎng)基專利，其斜面培養(yǎng)基配方為葡萄糖1.0%～3.0%、玉米粉 0～2.0%、土豆汁 0～1.0%、酵母粉0.1% ～1.0%、糊精0～1.0%、麩皮0.5%～2.0%、蠶蛹粉1.0%～3.0%、蛋白胨0～2.0%、硫酸鎂0～0.05%、磷酸二氫鉀0～0.05%、瓊脂粉0.5%～1.0%，其余為水;發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖1.0% ～1.5%、玉米漿0～1.0%、蠶蛹粉0.5%～1.0%、糖蜜1.0%～1.5%、黃豆餅粉1.0% ～2.0%、酵母膏0.5% ～1.0%、硫酸鎂0～0.05%、磷酸二氫鉀0～0.05%，其余為水。杜曉蒙等［17］利用Plackett－Burman(PB)試驗設(shè)計篩選出影響冬蟲夏草菌生長的關(guān)鍵培養(yǎng)基成分，然后利用最陡爬坡試驗和中心組合設(shè)計試驗優(yōu)化和確立最佳培養(yǎng)基配方組合，結(jié)果表明，葡萄糖、酵母粉和KH2PO4對冬蟲夏草菌的生長影響顯著，優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分為葡萄糖59.35 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉16.83 g/L、KH2PO41.47 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L，利用此培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的冬蟲夏草菌絲體產(chǎn)量為26.86 g/L，是優(yōu)化前的2.5倍。羅園香等［18］以菌絲體干質(zhì)量、胞內(nèi)多糖含量及腺苷含量為指標(biāo)，進(jìn)行冬蟲夏草菌的液態(tài)發(fā)酵條件研究，確定利用葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體、胞內(nèi)多糖及腺苷的最佳條件為裝液量100 mL/500 mL、接種量3%、溫度24℃、培養(yǎng)時間4 d、搖床轉(zhuǎn)速140 r/min;試驗得到菌絲體干質(zhì)量為17.232 g/L、胞內(nèi)多糖含量為78.34 ng/g、腺苷含量為633.7 ug/g。

綜上所述，冬蟲夏草菌栽培的適宜溫度為18～24℃;培養(yǎng)基含水量為60%;適宜的微量元素有利于菌絲體的生長;碳源、氮源對菌絲體均有所影響;搖床適宜轉(zhuǎn)速為100～200 r/min;動物性氮源較佳;pH值為5.0～7.0;不同培養(yǎng)條件的冬蟲夏草菌所含有效成分不同。雖然冬蟲夏草菌液體發(fā)酵技術(shù)取得好的進(jìn)展，但在評價指標(biāo)體系方面還未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

4 研究展望

目前，冬蟲夏草菌巨大的市場潛力正在迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槭袌鲂枨?，但冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)化發(fā)展中存在產(chǎn)量低、成本高、工廠化模式生產(chǎn)不成熟、寄主蝠蛾生長周期長、易遭受病害侵襲等問題，而人工液體栽培有著無可替代的優(yōu)勢，其培養(yǎng)成本低、周期短、繁殖速度快，是今后冬蟲夏草菌人工栽培研究的主要方向。試驗結(jié)果表明，采用發(fā)酵的方法大量生產(chǎn)冬蟲夏草菌絲體來代替天然冬蟲夏草，無論從理論上還是技術(shù)上都得到了一定的支持［19－25］。發(fā)酵法生產(chǎn)冬蟲夏草菌絲體已成為今后的一個發(fā)展趨勢，對保護(hù)日益減少的冬蟲夏草生態(tài)資源具有重要的意義，可為逐漸增長的市場需求提供行之有效的解決方法。

在工業(yè)化液體發(fā)酵培養(yǎng)上，應(yīng)注意一些不容忽視的問題:為確保發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體的食用、藥用價值，需提供一個最適合真菌產(chǎn)生的工業(yè)發(fā)酵條件及優(yōu)良菌種的篩選條件;當(dāng)菌種應(yīng)用于規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)后，解決菌種退化與變異問題是重中之重。目前冬蟲夏草菌的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)尚未形成，有待進(jìn)一步完善。有性型冬蟲夏草人工培育的工業(yè)化有待加快步伐。

［1］梁宗琦.中國真菌志:冬蟲夏草屬 (第三十二卷)［M］.北京:科學(xué)出版社，2007.

［2］陳仕江，鐘國躍，馬開森.珍稀名貴藥材冬蟲夏草資源可持續(xù)利用的思考與建議［J］.重慶中草藥研究，2006(2):8－10.

［3］李增智，黃勃，李春如，等.確證冬蟲夏草無性型的分子生物學(xué)證據(jù)L中國被毛孢與冬蟲夏草之間的關(guān)系［J］.菌物系統(tǒng)，2000，19(1):60－64.

［4］黃麗俊，李利東，袁建新，等.冬蟲夏草研究現(xiàn)狀及展望［J］.農(nóng)學(xué)學(xué)報，2014，4(8):63－65.

［5］王忠，馬啟龍.甘肅冬蟲夏草菌分離培養(yǎng)研究［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2001(7):43－44.

［6］劉錫琎，郭英蘭，俞永信，等.冬蟲夏草菌無性階段的分離和鑒定 ［J］.真菌學(xué)報.1989(8):35－40.

［7］宋宇琪，王蕾，郭素萍.冬蟲夏草菌及其菌絲體的研究進(jìn)展［J］.科技情報開發(fā)與經(jīng)濟(jì)，2008，18(29):98－99.

［8］吳彩琴，陳野，郝迎.固體發(fā)酵生產(chǎn)冬蟲夏草多糖的研究［J］.食品科學(xué)，2009(7):186－189.

［9］葛飛，桂琳，李春如，等.冬蟲夏草無性型—中國被毛孢固態(tài)發(fā)酵條件的初步研究 ［J］.生物學(xué)雜志，2009(3):22－25.

［10］王祥誠，余有貴，程里，等.冬蟲夏草固態(tài)發(fā)酵蕨渣生產(chǎn)菌質(zhì)多糖［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31(7):148－150.

［11］張安寧，袁書林，孫林超，等.4種蟲草真菌生長適宜碳、氮源的研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(6):404－406.

［12］周宇爝，江明艷，姜福星，等.不同氮源對中國被毛孢生長的影響［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40(18):22－24.

［13］劉欣，張宗豪，徐海峰，等.冬蟲夏草菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究［J］.食用菌，2013(1):14－16.

［14］尚德靜，王孝敏.冬蟲夏草深層發(fā)酵的研究［J］.中國食用菌，1996，15(6):48－49.

［15］張忠廣，喬正強(qiáng)，柳慧玲，等.冬蟲夏草菌液體發(fā)酵培養(yǎng)試驗初報［J］.食用菌，2006(增刊):25－31.

［16］李邦良，許靜，王珍，等.一種用于生產(chǎn)冬蟲夏草菌絲體的培養(yǎng)基 ［J］.中國.101096641［P］.2008－01－02.

［17］杜曉蒙，孫海龍，崔建東.培養(yǎng)基成分對冬蟲夏草菌的生長的影響及其優(yōu)化 ［J］.中國釀造，2011(3):72－74.

［18］羅園香，盛嘉俊，葉克難.一株冬蟲夏草菌的液態(tài)發(fā)酵條件研究［J］.中國釀造，2015(4):78－81.

［19］趙錦，王寧，陳月琴，等.冬蟲夏草無性型的分子鑒別［J］.中山大學(xué)學(xué)報:自然學(xué)報版，1999，38(1):123－125.

［20］王寧，陳月琴，章衛(wèi)民，等.蟲草屬多元起源的分子生物學(xué)證據(jù)［J］.中山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2000，39(4):70－73.

［21］章衛(wèi)民，李泰輝，等.西藏冬蟲夏草無性型的分子生物研究［J］.微生物學(xué)通報，2002，29(3):54－58.

［22］蔣毅，姚一建.蟲草屬分子系統(tǒng)學(xué)研究現(xiàn)狀［J］.菌物研究，2004，2(1):58－67.

［23］李伯輝，童應(yīng)凱，等.冬蟲夏草液體深層發(fā)酵中試試驗［J］.食品研究與開發(fā)，1997(3):17－18.

［24］張忠廣，喬正強(qiáng)，等.冬蟲夏草液體發(fā)酵培養(yǎng)實驗初報［J］.食用菌，2006(Z):25，31.

［25］吳玲芳，王曉瑞，等.冬蟲夏草液體發(fā)酵培養(yǎng)的研究進(jìn)展［J］.發(fā)酵科技通訊，2014，43(4):25－29.