咪唑克生對(duì)體外血腦屏障炎癥模型通透性的影響*

王新施， 朱 攀， 朱振國(guó)， 夏念格， 李 佳， 鄭榮遠(yuǎn)

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325000)

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咪唑克生對(duì)體外血腦屏障炎癥模型通透性的影響*

王新施， 朱 攀， 朱振國(guó)， 夏念格， 李 佳， 鄭榮遠(yuǎn)△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325000)

目的： 觀察咪唑克生(idazoxan，IDA)對(duì)體外血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)炎癥模型的通透性、緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)和分布及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)和MMP-9抑制物——金屬蛋白酶組織抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1， TIMP-1)表達(dá)的影響。 方法: 采用培養(yǎng)7 d的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株 b.End3建立體外BBB模型，采用TNF-α(10 nmol/L)處理24 h誘導(dǎo)BBB炎癥模型，并對(duì)BBB炎癥模型分別采用IDA 50、100、200 μmol/L預(yù)處理6 h以觀察IDA對(duì)BBB炎癥模型的作用。通過(guò)檢測(cè)異硫氰酸熒光標(biāo)記的葡聚糖通過(guò)率來(lái)確立模型的通透性，采用Western blot法檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，通過(guò)免疫熒光法觀察ZO-1的分布情況，并通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)MMP-9/TIMP-1的表達(dá)。結(jié)果: 培養(yǎng)7 d的b.End3細(xì)胞匯合成穩(wěn)定的單層連接，有較好的屏障功能，而采用TNF-α處理24 h后誘導(dǎo)的BBB炎癥模型的通透性明顯升高，緊密連接蛋白ZO-1在膜上的表達(dá)明顯減少、不連續(xù)，Western blot法顯示ZO-1蛋白表達(dá)水平明顯下降，MMP-9的表達(dá)明顯升高；而采用IDA 50、100、200 μmol/L預(yù)處理6 h能明顯降低其通透性，增加ZO-1蛋白的表達(dá)和改善ZO-1的分布異常，降低MMP-9的表達(dá)，其中200 μmol/L IDA作用最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論: IDA能夠直接作用于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，降低TNF-α誘導(dǎo)的體外BBB炎癥模型MMP-9的表達(dá)，增加緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)、修復(fù)緊密連接ZO-1的異常分布，從而改善其異常增高的通透性。

咪唑克生； 血腦屏障； 緊密連接； ZO-1; 基質(zhì)金屬蛋白酶-9； 組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1

血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)功能失調(diào)是多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)及其動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的一個(gè)重要病理途徑。研究發(fā)現(xiàn)，在EAE發(fā)病時(shí)及MS臨床復(fù)發(fā)時(shí)都存在BBB功能失調(diào)，BBB通透性增加，導(dǎo)致外周炎癥細(xì)胞和炎癥因子向中樞遷移，是EAE發(fā)病的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，BBB的通透性與EAE的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[1]。但EAE/MS中BBB破壞的機(jī)制仍不明確。研究發(fā)現(xiàn)EAE/MS中BBB破壞的機(jī)制可能與基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)活性增高或MMP-9抑制物——金屬蛋白酶組織抑制物-1(tissue inhibitors of metalloproteinase-1， TIMP-1)的平衡失調(diào)及BBB緊密連接蛋白-1(zonula occludens proteins-1，ZO-1)的表達(dá)異常等有關(guān)[2-4]。我們?cè)谇捌诘难芯抗ぷ髦幸寻l(fā)現(xiàn)咪唑啉2受體(imidazoline 2 receptor，I2R)的配體咪唑克生(idazoxan，IDA)能增加BBB緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，降低MMP-9的表達(dá)，降低EAE炎癥時(shí)異常增高的BBB通透性，從而減輕小鼠EAE時(shí)的BBB破壞、抑制中樞炎癥反應(yīng)并減緩小鼠EAE的病情[5-6]。但I(xiàn)DA對(duì)EAE的保護(hù)作用是否直接繼發(fā)于其對(duì)BBB的保護(hù)作用仍未知，IDA在體外對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的直接作用目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。故本課題擬采用小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞b.End3單層細(xì)胞培養(yǎng)建立體外BBB模型，并采用MS/EAE發(fā)病起關(guān)鍵作用的炎癥細(xì)胞因子TNF-α誘導(dǎo)BBB炎癥模型，以模擬EAE時(shí)的BBB破壞，觀察IDA干預(yù)對(duì)體外BBB炎癥模型的通透性、緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)和分布及MMP-9/TIMP-1表達(dá)的影響來(lái)探討IDA對(duì)BBB的直接作用及相關(guān)的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株 b.End 3購(gòu)自ATCC；Transwell培養(yǎng)板 (0.4 μm孔徑，24孔板) 購(gòu)自Corning；DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640購(gòu)自HyClone；胎牛血清購(gòu)自Gibco；PBS、0.25%胰蛋白酶、結(jié)晶紫購(gòu)自基爾頓生物科技(上海)有限公司；羊抗兔FITC標(biāo)記 II 抗、羊抗鼠Alexa flour 555標(biāo)記 II 抗購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；ZO-1抗體購(gòu)自Santa Cruz；MMP-9抗體購(gòu)自Abcam；TRIzol購(gòu)自Invitrogen； RT-PCR 試劑盒購(gòu)自TaKaRa；MMP-9、 TIMP-1、GAPDH 引物由寶生物工程有限公司合成；異硫氰酸熒光標(biāo)記的葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran，F(xiàn)D-40)購(gòu)自 Sigma；其余生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 b.End3細(xì)胞培養(yǎng) 將b.End3細(xì)胞接種于明膠包被的玻片或24孔板的Transwell培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基加入10%胎牛血清、4.5 g/L葡萄糖、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～4 d傳代 1 次，倒置相差顯微鏡下每日觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.2 模型分組 在培養(yǎng)的第7天細(xì)胞已匯合成穩(wěn)定的單層連接后，按照干預(yù)因素不同將模型分為：① 空白對(duì)照(control)組：不加任何干預(yù)的單層b.End3細(xì)胞構(gòu)成的正常體外BBB模型；② TNF-α組：采用TNF-α(10 nmol/L)處理24 h誘導(dǎo)的BBB炎癥模型；③ IDA50+TNF-α組：采用IDA 50 μmol/L預(yù)處理6 h后，再采用TNF-α (10 nmol/L)處理24 h誘導(dǎo)BBB炎癥模型；④ IDA100+TNF-α組：采用IDA 100 μmol/L預(yù)處理6 h后，再采用TNF-α(10 nmol/L)處理24 h誘導(dǎo)BBB炎癥模型；⑤ IDA200+TNF-α組：采用IDA 200 μmol/L預(yù)處理6 h后，再采用TNF-α (10 nmol/L)干預(yù)24 h誘導(dǎo)BBB炎癥模型。

2.3 模型通透性檢測(cè) 每次以1×107/L的密度將b.End3細(xì)胞懸液約0.3 mL接種于24孔板Transwell培養(yǎng)板內(nèi)池，并于培養(yǎng)板外池加入培養(yǎng)基1.2 mL，保證培養(yǎng)板內(nèi)外池兩側(cè)液面相等，倒置相差顯微鏡下每日觀察細(xì)胞形態(tài)變化。利用FD-40通過(guò)率檢測(cè)培養(yǎng)第7天已匯合成單層穩(wěn)定連接的細(xì)胞層的通透性。FD-40加入膜上層，終濃度為0.1 mg/L。30 min后，收集基底膜上的細(xì)胞樣品。利用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm。以上實(shí)驗(yàn)均做3復(fù)孔。

2.4 Western blot法檢測(cè)ZO-1的表達(dá) 取各組培養(yǎng)7 d的b.End3細(xì)胞提取總蛋白，定量后-70 ℃保存。取50 μg總蛋白樣品，8 % SDS-PAGE分離蛋白，4 ℃濕轉(zhuǎn)至PDVF膜上，封閉過(guò)夜。加入稀釋的 I 抗ZO-1(1∶1 000)和內(nèi)參照β-actin(1∶500)，室溫下結(jié)合 2 h。TBST洗膜10 min×4次，然后加入稀釋的 II 抗(1∶1 000)，室溫下結(jié)合 2 h，再以TBST 洗膜10 min×4次。將膜置于KCTM 化學(xué)發(fā)光試劑盒中室溫孵育3 min，以X 光膠片曝光成像后用Image J 圖像分析軟件分析各條帶的平均灰度值。

2.5 免疫熒光法檢測(cè)ZO-1的表達(dá) 將明膠包被過(guò)的蓋玻片置于24孔板中，長(zhǎng)成單層的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)，稀釋為5×108/L，接種于蓋玻片上，培養(yǎng)至第7 天，取出培養(yǎng)皿，用PBS(pH 7.4)洗2 min×2次；加入4%多聚甲醛室溫固定15 min；0.5% Triton X-100透明化后，以5% BSA室溫封閉2 h；加ZO-1 I抗(1∶100)，4 ℃過(guò)夜；PBS洗滌5 min×2次；然后加 II 抗(1∶500)，37 ℃孵育1 h； PBS洗滌5 min×2次；加入DAPI(1∶100)37 ℃避光1～2 min，PBS洗3 min×4次，用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞染色結(jié)果。

2.6 RT-PCR法檢測(cè)MMP-9/TIMP-1的mRNA表達(dá) 按照TRIzol一步法提取各組細(xì)胞總RNA后根據(jù)RT-PCR試劑盒說(shuō)明合成cDNA。MMP-9的PCR引物參考序列號(hào)為NM_004994.2，正義鏈為5’-TCAGGGAGACGCCCATTTC-3’，反義鏈為5’-ATTGCCGTCCTGGGTGTAG-3’，產(chǎn)物253 bp；TIMP-1引物參考序列為NM_003254.2，正義鏈為5’-ATTCCGACCTCGTCATCAG-3’，反義鏈為5’-CATTCCTCACAGCCAACAG-3’，產(chǎn)物340 bp；GAPDH參考序列號(hào)為NM_001256799.2，正義鏈為5’-CATCATCCCTGCCTCTACTG-3’，反義鏈為5’-TGGGTGTCGCTGTTGAAG-3’，產(chǎn)物258 bp。取正義和反義引物各200 ng和1或2 μL的cDNA按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明組成20 μL的PCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件為94 ℃5 min; 94 ℃ 30 s， 56 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 30個(gè)循環(huán); 72 ℃ 7 min。取PCR產(chǎn)物5 μL用2%的瓊脂糖凝膠電泳，用Gel Documentation System(Biosens SC6200)凝膠成像系統(tǒng)和Gel-Pro 3.2分析結(jié)果，以目的基因與GAPDH的灰度值之比作為反映目的基因mRNA相對(duì)水平的指標(biāo)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較用Student-t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料(發(fā)病率)的比較則采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞培養(yǎng)及通透性的檢測(cè)結(jié)果

倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)7 d的b.End3細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或三角形，細(xì)胞排列緊密，單層生長(zhǎng)，互不重疊，匯合成片呈鋪路卵石樣結(jié)構(gòu)，具有良好的屏障功能。培養(yǎng)第7天，細(xì)胞層對(duì)FD-40的通透率較培養(yǎng)第1天的細(xì)胞樣品和空白對(duì)照(未接種細(xì)胞)明顯下降，標(biāo)志著B(niǎo)BB體外模型的成功制備，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The incubation of b.End3 cells and measurement of permeability. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs7 d.

圖1 b.End3細(xì)胞培養(yǎng)情況和通透性檢測(cè)

2 TNF-α和IDA干預(yù)后的各組通透性檢測(cè)結(jié)果

采用TNF-α(10 nmol/L)處理24 h后誘導(dǎo)的BBB炎癥模型的通透性明顯升高，提示BBB炎癥模型的成功制備。采用IDA 50、100、200 μmol/L預(yù)處理6 h后，再采用TNF-α(10 nmol/L)處理24 h誘導(dǎo)BBB炎癥模型時(shí)，發(fā)現(xiàn)各IDA預(yù)處理組模型的通透性均明顯下降，尤其以200 μmol/L作用更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示IDA對(duì)炎癥導(dǎo)致的BBB破壞、通透性升高具有明顯的改善作用，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The permeability of FD-40 in different groups. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsTNF-α group.

圖2 各組模型對(duì)FD-40的通透性檢測(cè)

3 ZO-1的 Western blot檢測(cè)結(jié)果

空白對(duì)照組可檢測(cè)到較穩(wěn)定的BBB緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，采用TNF-α(10 nmol/L)處理24 h后誘導(dǎo)的BBB炎癥模型ZO-1的表達(dá)明顯減少。采用IDA 50、100 μmol/L預(yù)處理后再以TNF-α誘導(dǎo)BBB炎癥模型的IDA50+TNF-α組及IDA100+TNF-α組ZO-1蛋白的表達(dá)呈增加趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而采用IDA 200 μmol/L預(yù)處理后再以TNF-α誘導(dǎo)BBB炎癥模型的IDA200+TNF-α組ZO-1的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示IDA預(yù)處理能上調(diào)BBB炎癥模型的緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The protein expression of ZO-1 detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTNF-α group.

圖3 ZO-1 蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果

4 ZO-1的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

空白對(duì)照組可見(jiàn)BBB緊密連接蛋白ZO-1主要分布在細(xì)胞膜上、表達(dá)連續(xù)，采用TNF-α(10 nmol/L)

Figure 4.The distribution of ZO-1 in each groups detected by immunofluorescence (×400).

圖4 ZO-1免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果

處理24 后誘導(dǎo)的BBB炎癥模型ZO-1在膜上的表達(dá)明顯減少、變得不連續(xù)，并進(jìn)入細(xì)胞漿內(nèi)。IDA50+TNF-α組及IDA100+TNF-α組ZO-1蛋白的分布無(wú)明顯變化。而IDA200+TNF-α組中，ZO-1在膜上的表達(dá)增加、分布明顯趨向連續(xù)，提示IDA 200 μmol/L預(yù)處理能改善TNF-α誘導(dǎo)的BBB炎癥模型緊密連接蛋白ZO-1的異常分布，見(jiàn)圖4。

5 MMP-9/TIMP-1的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

空白對(duì)照組可檢測(cè)到較低水平的MMP-9的表達(dá)，采用TNF-α(10 nmol/L)處理24 h后誘導(dǎo)的BBB炎癥模型MMP-9的表達(dá)明顯增加，而TIMP-1的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。IDA50+TNF-α組MMP-9的mRNA表達(dá)呈減少趨勢(shì)，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而IDA100+TNF-α及IDA200+TNF-α組MMP-9的表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而IDA各處理組的TIMP-1的表達(dá)均無(wú)明顯變化，提示IDA預(yù)處理能下調(diào)BBB炎癥模型的MMP-9的表達(dá)，但對(duì)TIMP-1的表達(dá)無(wú)明顯影響，見(jiàn)圖5、表1。

Figure 5.The mRNA expression of ZO-1 detected by RT-PCR.M:marker.

圖5 MMP-9/TIMP-1半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

表1 各組MMP-9/TIMP-1的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

Table 1.The mRNA expression of MMP-9/TIMP-1 (Mean±SD.n=3)

GroupMMP-9/GAPDHTIMP-1/GAPDHControl0.46±0.03**0.92±0.03**TNF-α0.80±0.020.81±0.02IDA50+TNF-α0.76±0.030.82±0.03IDA100+TNF-α0.68±0.03**0.83±0.03IDA200+TNF-α0.55±0.03**0.84±0.02

**P<0.01vsTNF-α group.

討 論

BBB主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜、膠質(zhì)細(xì)胞組成，膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)終足與內(nèi)皮細(xì)胞相聯(lián)系。其中，內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接是BBB機(jī)能與結(jié)構(gòu)的主要基礎(chǔ)[7]。緊密連接位于連接復(fù)合體最頂端的組成部分，是由跨膜蛋白包括咬合蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudins)、連接黏附分子(junctional adhesion molecules，JAMs)、ZOs以及細(xì)胞骨架蛋白(主要是微絲蛋白actin)等共同組成的。電鏡下可見(jiàn)到相鄰細(xì)胞兩層質(zhì)膜緊緊靠在一起形成緊密連接，細(xì)胞-細(xì)胞膜的連接無(wú)空隙，如同焊條，發(fā)揮著屏障作用。BBB功能失調(diào)是MS/EAE的一個(gè)重要病理途徑，研究發(fā)現(xiàn)，在EAE發(fā)病時(shí)及MS臨床復(fù)發(fā)時(shí)都存在BBB功能失調(diào)，BBB通透性增加導(dǎo)致外周炎癥細(xì)胞和炎癥因子向中樞遷移是EAE/MS發(fā)病的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，BBB的通透性與EAE的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[1]。但EAE/MS中BBB破壞的機(jī)制仍不明確。研究發(fā)現(xiàn)EAE/MS中BBB破壞的機(jī)制可能與緊密連接的異常如腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上ZO-1的表達(dá)減少、Claudin-5的缺失或者下調(diào)等密切相關(guān)[2-4]。EAE/MS時(shí)，中樞的炎癥因子如TNF-α等能誘發(fā)MMP-9的產(chǎn)生[8]， MMP-9作為最重要的降解BBB的酶，不但能降解基底膜，也能降解BBB緊密連接蛋白ZO-1，導(dǎo)致BBB開(kāi)放，炎癥細(xì)胞和炎癥因子進(jìn)入CNS誘發(fā)MS/EAE[9]。在MS/EAE活動(dòng)期，MMP-9濃度升高，或者M(jìn)MP-9與其抑制物TIMP-1的平衡失調(diào)導(dǎo)致MMP-9活性明顯增加，被認(rèn)為是MS/EAE的一個(gè)重要活動(dòng)性標(biāo)志[10]。并且，研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是作為MS急性期主要治療藥物的糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)還是作為MS慢性期主要治療藥物的IFN-β都能下調(diào)MMP-9的表達(dá)或上調(diào)TIMP-1的表達(dá),并無(wú)法調(diào)節(jié)體外BBB 模型的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)來(lái)降低BBB通透性[11-14]。綜上所述，通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白的表達(dá)降低BBB通透性可能是MS/EAE的重要治療靶點(diǎn)。

我們?cè)谇捌诘难芯抗ぷ髦幸寻l(fā)現(xiàn)咪唑2受體配體IDA具有減緩大鼠EAE發(fā)病的作用[15-16]，然而該保護(hù)作用的機(jī)制不甚清楚。而我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)，咪唑克生具有拮抗NMDA受體介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流、降低谷氨酸興奮毒性的作用[17]。而已有研究發(fā)現(xiàn)NMDA受體拮抗劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有改善BBB通透性、減緩EAE發(fā)病的作用[18]，在體外實(shí)驗(yàn)中能調(diào)節(jié)緊密連接蛋白ZO-1 和 occludin的分泌、提高BBB體外模型的屏障功能[19]。因此，我們推斷具有NMDA受體拮抗作用的IDA也可能具有調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)從而調(diào)控BBB通透性的作用。在以上的理論假設(shè)的基礎(chǔ)上，我們?cè)诮诘脑隗w實(shí)驗(yàn)研究中已經(jīng)觀察到，給予IDA 2 mg/kg(腹腔注射、2次/d、共15 d)進(jìn)行干預(yù)后，能明顯降低EAE炎癥時(shí)異常增高的BBB通透性，增加BBB緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，降低MMP-9的表達(dá)，從而減輕小鼠EAE時(shí)的BBB破壞，抑制中樞炎癥反應(yīng)，減緩小鼠EAE的病情[5-6]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證IDA對(duì)EAE的保護(hù)作用是否直接繼發(fā)于其對(duì)BBB的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察IDA對(duì)體外BBB炎癥模型通透性的直接影響，并通過(guò)Western blot法定量檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1的蛋白表達(dá)量、采用免疫熒光法觀察ZO-1的分布情況并通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)MMP-9/TIMP-1的表達(dá)來(lái)探討IDA對(duì)BBB的直接作用。為了與小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一，我們參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)采用了小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系b.End3細(xì)胞體外培養(yǎng)建立體外BBB模型[20-21]，并采用MS/EAE時(shí)最重要的炎癥細(xì)胞因子TNF-α作為炎癥刺激因子誘導(dǎo)建立體外BBB炎癥模型以模擬MS/EAE時(shí)BBB的破壞[22]。與既往這些研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)顯示培養(yǎng)7 d的b.End3細(xì)胞具有良好的屏障功能，能較好地阻隔大分子量物質(zhì)FD-40(分子量40 000 kD)的通過(guò)，ZO-1的Western blot及免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞間能形成穩(wěn)定、連續(xù)的細(xì)胞間緊密連接，而RT-PCR結(jié)果顯示其能分泌少量的MMP-9及TIMP-1。采用炎癥因子TNF-α處理后，F(xiàn)D-40的通過(guò)率明顯增加，提示細(xì)胞屏障功能破壞；后續(xù)的免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示緊密連接蛋白ZO-1在膜上的表達(dá)明顯減少、不連續(xù)，Western blot結(jié)果顯示ZO-1蛋白表達(dá)水平明顯下降，提示細(xì)胞間緊密連接破壞，同時(shí)RT-PCR結(jié)果提示MMP-9的表達(dá)明顯升高、TIMP-1表達(dá)降低，較好地模擬了EAE時(shí)的BBB炎癥破壞[1-4, 10]。采用IDA 50、100和200 μmol/L預(yù)處理6 h后均能明顯改善BBB炎癥模型的通透性，且呈現(xiàn)隨劑量增加作用加強(qiáng)的趨勢(shì)，以IDA 200 μmol/L的劑量作用最強(qiáng)；IDA 100和200 μmol/L組的MMP-9均明顯降低，而只有IDA 200 μmol/L組能明顯增加ZO-1蛋白的表達(dá)、改善TNF-α引起的緊密連接破壞、ZO-1的分布異常，提示IDA改善BBB炎癥模型通透性的作用可能隨劑量增加而增強(qiáng)，其作用機(jī)制包括降低MMP-9的表達(dá)、增加ZO-1的表達(dá)和改善其分布，而具體的劑量效應(yīng)關(guān)系及最合適的體內(nèi)劑量尚有待進(jìn)一步的研究探討。

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Effect of idazoxan on permeability of inflammatory blood-brain barrier modelinvitro

WANG Xin-shi, ZHU Pan, ZHU Zhen-guo, XIA Nian-ge, LI Jia, ZHENG Rong-yuan

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:zhengry2013@163.com)

AIM: To study the effect of idazoxan on the permeability of inflammatory blood-brain barrier (BBB) modelinvitroand the expression of tight junction protein ZO-1. METHODS:InvitroBBB model was established by murine brain endothelial cell line bEnd.3 incubated for 7 d. The cells were treated with TNF-α (10 nmol/L) for additional 24 h to establish the inflammatory BBB model, which was pretreated with IDA at doses of 50, 100 and 200 μmol/L, respectively. The permeability was measured using fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran (FD-40, MW 40,000), the expression of ZO-1 was detected by Western blot analysis, the distribution of ZO-1 was observed by immunofluorescence, and the mRNA expression of MMP-9/TIMP-1 was measured by RT-PCR.RESULTS: After incubated for 7 d, b.End3 cells converged to be confluent monolayer with low permeability. The inflammatory BBB model induced by TNF-α treatment displayed much higher permeability with decreased expression of tight junction protein ZO-1, destroyed distribution of ZO-1 and increased mRNA expression of MMP-9. When pretreated with IDA, the permeability was greatly decreased, the expression of ZO-1 was greatly increased, the abnormal distribution of ZO-1 was greatly ameliorated and the mRNA expression of MMP-9 was obviously reduced. The effect was most significant in IDA (200 μmol/L)-pretreated group (P<0.01). CONCLUSION: IDA directly acts on brain endothelial cells to reduce the expression of MMP-9, increase the expression of tight junction protein ZO-1 and ameliorate the destroyed distribution of ZO-1 in the inflammatory BBB, thus reversing the abnormally elevated permeability in a inflammatory BBB modelinvitroinduced by TNF-α.

Idazoxan; Blood-brain barrier; Tight junction; ZO-1; Matrix metalloproteinases-9; Tissue inhibitors of metalloproteinase-1

1000- 4718(2015)04- 0669- 06

2015- 01- 07

2015- 03- 16

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. LQ12H09002); 溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. Y20140283)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.017

△通訊作者 Tel: 0577-55589361; E-mail: zhengry2013@163.com