CX3CR1參與雷公藤內(nèi)酯對(duì)MPP+帕金森病大鼠多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用*

周子懿， 高俊鵬， 向 軍， 陳依萍， 蔡業(yè)峰， 羅恩麗△， 蔡定芳△

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)院腦病一科，廣東 廣州 510120； 2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510180； 3復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)病學(xué)研究室，上海 200032)

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CX3CR1參與雷公藤內(nèi)酯對(duì)MPP+帕金森病大鼠多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用*

周子懿1▲， 高俊鵬2▲， 向 軍3， 陳依萍3， 蔡業(yè)峰1， 羅恩麗1△， 蔡定芳3△

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)院腦病一科，廣東 廣州 510120；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510180；3復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)病學(xué)研究室，上海 200032)

目的： 探討雷公藤內(nèi)酯對(duì)1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)帕金森病模型大鼠的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。方法: 采用MPP+黑質(zhì)內(nèi)注射建立帕金森病大鼠模型。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、模型組、雷公藤內(nèi)酯組及其溶劑對(duì)照組，利用酪氨酸羥化酶(TH)免疫熒光強(qiáng)度測(cè)定多巴胺神經(jīng)元存活率、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物OX-42免疫熒光強(qiáng)度測(cè)定小膠質(zhì)細(xì)胞激活程度、Western blotting測(cè)定趨化因子受體CX3CR1表達(dá)量。結(jié)果: 免疫組化結(jié)果表明，MPP+黑質(zhì)內(nèi)注射可使模型組OX-42免疫熒光強(qiáng)度增高，DA神經(jīng)元進(jìn)行性變性死亡。雷公藤內(nèi)酯組OX-42免疫熒光強(qiáng)度較模型組低(P<0.01)，TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較模型組多(P<0.01)。Western blotting結(jié)果提示雷公藤內(nèi)酯組CX3CR1表達(dá)量較模型組低(P<0.05)。結(jié)論: 雷公藤內(nèi)酯對(duì)MPP+帕金森病大鼠模型具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活有關(guān)，抑制CX3CR1可能是其抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的途徑之一。

帕金森??； 小膠質(zhì)細(xì)胞； 雷公藤內(nèi)酯； 多巴胺能神經(jīng)元

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常見(jiàn)的神經(jīng)變性運(yùn)動(dòng)障礙疾病，其病理基礎(chǔ)是中腦黑質(zhì)(substantia nigra，SN)區(qū)域多巴胺(dopamine，DA)神經(jīng)元進(jìn)行性變性死亡，并引起紋狀體DA含量的下降?，F(xiàn)有治療方法雖然可以減輕大部分患者臨床癥狀，但無(wú)法阻止或延緩DA神經(jīng)元的進(jìn)行性死亡。神經(jīng)炎癥反應(yīng)(neuroinflammation)作為一種重要的PD致病因素，正受到越來(lái)越多的關(guān)注。無(wú)論在PD動(dòng)物模型，還是PD患者中，都存在以小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)激活為特征的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的固有免疫細(xì)胞，其活化后可分泌白細(xì)胞介素(interleukin，IL)1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)α、趨化因子等，損傷DA神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元變性過(guò)程[1-2]。

雷公藤是免疫抑制能力較強(qiáng)的藥物之一，用于治療炎癥與自身免疫疾病在我國(guó)已有很長(zhǎng)的歷史。在雷公藤提取出的9種有生物活性的化合物中，雷公藤內(nèi)酯(triptolide)是抗炎及免疫抑制作用較強(qiáng)的單體[3]。本研究擬在1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)-PD大鼠模型中，觀察雷公藤內(nèi)酯對(duì)PD模型鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制作用，并從趨化因子受體CX3CR1的角度探討其可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物及分組

清潔級(jí)健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體重250～280 g，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠飼養(yǎng)在恒溫、通風(fēng)良好的環(huán)境中，每天接受12 h的光照，同時(shí)供以充足的食物和水。并在每次實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)性訓(xùn)練，以排除應(yīng)激干擾。實(shí)驗(yàn)中大鼠共分為為假手術(shù)組、MPP+模型組、雷公藤內(nèi)酯組和溶劑對(duì)照組。MPP+模型組大鼠僅接受MPP+注射，分別在造模后第0、1、3、7、14、21天進(jìn)行免疫組織化學(xué)及Western blotting檢測(cè)。其它各組大鼠分別在第7天進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，第21天進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

2 試劑和藥品

MPP+、阿樸嗎啡、正常驢血清和抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase， TH)抗體(Sigma)；雷公藤內(nèi)酯(中國(guó)藥品生物制品檢定所，HPLC純度99%)；OX-42抗體和驢抗兔 IgG(Chemicon)；山羊抗CX3CR1 抗體Santa Cruz)。

3 方法

3.1 MPP+-PD大鼠模型的建立及動(dòng)物給藥 造模藥物MPP+注射劑量參照先前文獻(xiàn)[4]，大鼠麻醉后，將其頭部固定于立體定位儀，緩慢將2 μL MPP+(10 μg)以0.4 μL/min速度立體定向注射入左側(cè)SN。假手術(shù)組給予生理鹽水2 μL代替MPP+，注射方法同上。模型組大鼠僅接受MPP+注射，雷公藤內(nèi)酯組于造模后以5 μg/kg劑量用生理鹽水配成0.2 mL腹腔注射，每日 1 次。溶劑對(duì)照組給予等量生理鹽水腹腔注射，方法同上。

3.2 免疫組織化學(xué)測(cè)定與定量分析 大鼠在烏拉坦(1.5 g/kg ip)深度麻醉下，經(jīng)左心室向升主動(dòng)脈灌注37 ℃生理鹽水150 mL，然后用4 ℃ 4%的多聚甲醛400 mL固定液灌注固定。灌注完畢立即剝?nèi)〈竽X，置于上述固定液中后固定2 h后置入10%蔗糖溶液中(4 ℃)；4～6 h后換入20%蔗糖，組織塊沉底后，再換30%蔗糖至沉底。利用冷凍切片機(jī)(Leica)做大腦冠狀面連續(xù)切片，片厚30 μm。漂片于切片保護(hù)液中，備用。從切片保護(hù)液中隨機(jī)挑取大腦薄片，每只大鼠6～8張；0.01 mol/L PBS漂洗，10 min 3次，10%正常驢血清(含0.3 % Triton X-100的0.01 mol/L PBS配制)封閉，4 ℃過(guò)夜。兔抗酪氨酸羥化酶(1∶1 000)，或mouse-anti-OX-42(1∶1 000)，4 ℃孵育40 h。0.01 mol/L PBS漂洗10 min 3次。若丹明偶聯(lián)的驢抗兔IgG (1∶200)，室溫下避光孵育90 min。0.01 mol/L PBS漂洗10 min 3次，避光。熒光封片劑封片后于熒光顯微鏡下觀察。圖像的采集由Olympus數(shù)碼相機(jī)和相應(yīng)軟件Spot Advance完成。由于膠質(zhì)細(xì)胞在激活后發(fā)生腫脹變形，既定視野里用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法不足以反映膠質(zhì)細(xì)胞活性的增強(qiáng)，因此應(yīng)用Leica Qwin 500圖像分析軟件對(duì)黑質(zhì)區(qū)域OX-42的免疫熒光強(qiáng)度(OX-42-IR)進(jìn)行測(cè)定。每只動(dòng)物取6張切片，計(jì)算其平均光密度值，作為該例動(dòng)物的最終光密度。

3.3 DA神經(jīng)元損傷程度的檢測(cè) 參照Vaananen等[5]的方法，利用DA神經(jīng)元特異性標(biāo)志酶酪氨酸羥化酶染色計(jì)數(shù)多巴胺DA神經(jīng)元。TH是兒茶酚胺能神經(jīng)元合成兒茶酚胺的特異性限速酶，對(duì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元的定量是判定DA神經(jīng)元的存活情況的可靠指標(biāo)，可反映DA神經(jīng)元變性死亡的程度。采用熒光顯微鏡在40倍視野下對(duì)腦片SN pc區(qū)域TH陽(yáng)性神經(jīng)元進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，TH陽(yáng)性神經(jīng)元的相對(duì)定量可由損傷側(cè)(MPP+注射側(cè))TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量除以損傷對(duì)側(cè)(非注射側(cè))TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量，結(jié)果用百分比表示，各組間進(jìn)行比較。

3.4 Western blotting檢測(cè) 各組大鼠麻醉后，迅速斷頭取出造模同側(cè)中腦部位腦組織，約100 mg左右。將組織置于1～2 mL勻漿器中球狀部位，剪碎，置于裂解液中, 低溫勻漿，4 ℃、13 000 r/min 離心15 min,取上清。提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取總蛋白20 μg，15%SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到NC膜上，NC膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h；CX3CR1 I 抗(1∶2 000)或小鼠抗β-actin(1∶10 000) 4 ℃孵育24 h；辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的驢抗羊 II 抗(1∶5 000)或驢抗小鼠 II 抗(1∶1 000)室溫孵育2 h；化學(xué)發(fā)光法顯影，掃描。用圖像處理系統(tǒng)對(duì)條帶灰度進(jìn)行分析，以β-actin的表達(dá)量作內(nèi)參照。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，免疫組織化學(xué)結(jié)果采用成組樣本的t檢驗(yàn)(比較2種處理組的差異時(shí))或單因素方差分析跟隨組間t檢驗(yàn)(one-way ANOVA followed by Holm-Sidakt-test)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MPP+黑質(zhì)部位注射可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活、多巴胺能神經(jīng)元損傷

為了對(duì)MPP+注射后小膠質(zhì)細(xì)胞激活程度隨時(shí)間的變化情況加以評(píng)定，我們分別在造模后的0、1、3、7、14、21 d采用OX-42對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記并觀察。在假手術(shù)組中，大鼠黑質(zhì)區(qū)域OX-42著色的小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)出未被激活的形態(tài)，胞體較小，層形足板細(xì)長(zhǎng)，免疫著色較淺。而對(duì)于MPP+模型組，OX-42免疫陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，并呈現(xiàn)出被激活時(shí)的典型形態(tài)特征，胞體明顯增大，層形足板變厚變短。OX-42-IR值在MPP+注射3 d后較基線(第0天時(shí))比較開(kāi)始明顯升高(P<0.01)，7 d時(shí)達(dá)到最高峰(P<0.01)，在第14和21 天時(shí)略有下降，但與基線時(shí)比較仍存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)圖1A。

通過(guò)對(duì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元的測(cè)定，我們觀察到黑質(zhì)MPP+注射可導(dǎo)致同側(cè)DA神經(jīng)元進(jìn)行性變性死亡。重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果表明，TH陽(yáng)性神經(jīng)元存活率隨時(shí)間變化的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MPP+注射后第3天時(shí)與基線比較開(kāi)始明顯降低(P<0.05)，在第21天時(shí)，即本研究的終點(diǎn)，損傷同側(cè)TH陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量減少至對(duì)側(cè)的(8.60±1.21)%(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。

Figure 1.Microglia and dopaminergic neurons in the SN as revealed with OX-42 (A) and TH (B) immunoreactivity， respectively. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vs0 d.

圖1 MPP+損傷同側(cè)黑質(zhì)區(qū)域OX-42免疫熒光強(qiáng)度、TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量的變化情況

2 雷公藤內(nèi)酯對(duì)MPP+-PD大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況和DA神經(jīng)元存活率的影響

在假手術(shù)組大鼠的黑質(zhì)區(qū)域，OX-42的免疫著色較少，在MPP+模型鼠的黑質(zhì)區(qū)域，OX-42免疫陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出激活時(shí)的典型特征。在雷公藤內(nèi)酯給藥組中，OX-42-IR值顯著降低，同假手術(shù)組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)圖2，提示雷公藤內(nèi)酯系統(tǒng)性給藥可起到抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的作用。

對(duì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元的分析顯示，雷公藤內(nèi)酯可使損傷同側(cè)黑質(zhì)區(qū)域TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量升高到對(duì)側(cè)的(34.90±5.33)%，顯著高于MPP+模型組(P<0.05)。對(duì)于vehicle對(duì)照組，其OX-42-IR值和TH陽(yáng)性神經(jīng)元百分比同MPP+模型組相比無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effect of triptolide on MPP+-induced microglial activation and dopaminergic neurotoxicity in rats.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham;#P<0.05vsMPP+.

圖2 雷公藤內(nèi)酯對(duì)MPP+-PD大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況及DA神經(jīng)元存活情況的影響

3 CX3CR1 在MPP+-PD大鼠SN區(qū)域表達(dá)變化趨勢(shì)

CX3CR1蛋白在假手術(shù)組的SN區(qū)域有一定的表達(dá)量，CX3CR1表達(dá)量在MPP+造模后第3、7、14、21天均較假手術(shù)組升高(P<0.05)，在造模后第7天時(shí)升高尤為明顯，而造模后第1天組與假手術(shù)組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

4 雷公藤內(nèi)酯對(duì)MPP+-PD大鼠SN區(qū)域CX3CR1表達(dá)的影響

雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組CX3CR1表達(dá)量較模型組顯著下降(P<0.05)。vehicle對(duì)照組CX3CR1表達(dá)量與模型組差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。

討 論

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氫吡啶(MPTP)及其活性代謝產(chǎn)物MPP+是目前較常用的PD造模藥物。上世紀(jì)80年代在美國(guó)北加州吸毒者所使用的海洛因中混有MPTP，可形成與自發(fā)性PD難以分辨的癥候群[6]，是目前唯一在人類中發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致PD癥狀的神經(jīng)毒素。然而，當(dāng)利用MPTP系統(tǒng)給藥造模時(shí)，不但會(huì)引起DA神經(jīng)元損傷，還會(huì)影響到膠質(zhì)細(xì)胞的功能。因MPTP向MPP+的轉(zhuǎn)化主要是在星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)單胺氧化酶(monoamine oxidase, MAO)-B的催化作用下完成，影響MAO-B功能的藥物可能會(huì)加重MPTP的神經(jīng)毒性[7]，因此，選擇MPP+-PD大鼠作為研究對(duì)象，可避免因?qū)嶒?yàn)藥物對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的影響而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，已成為研究小膠質(zhì)細(xì)胞功能狀態(tài)與DA神經(jīng)元損傷之間關(guān)系的理想模型。

Fractalkine/CX3CL1(FKN)是趨化因子亞家族CX3C的成員，正常生理狀態(tài)下，F(xiàn)KN以膜分子形式廣泛表達(dá)于腦組織的神經(jīng)元細(xì)胞，其受體CX3CR1則主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞膜上[8]，是激活小膠質(zhì)細(xì)胞的重要靶點(diǎn)。Lee等[9]在CX3CR1基因敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞活性明顯下降。Shan等[2]用特異性抗體封閉CX3CR1可以減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度，并起到保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用。本研究觀察到，在MPP+注射后CX3CR1在第3天后逐漸升高，至第7天達(dá)到高峰，這與小膠質(zhì)細(xì)胞激活的時(shí)相吻合，進(jìn)一步印證了CX3CR1在小膠質(zhì)細(xì)胞激活中起到重要作用。抑制CX3CR1的表達(dá)或抑制其活性有望成為治療PD的靶點(diǎn)之一。

Figure 3.The expression levels of CX3CR1 in the SN area of MPP+-PD rats at different time points.Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vssham group.

圖3 CX3CR1 在MPP+-PD大鼠SN區(qū)域表達(dá)變化

Figure 4.The expression of CX3CR1 in different groups after 7 d of MPP+injection. 1: sham group； 2: MPP+group; 3: MPP++ triptolide group; 4: MPP++ vehicle group.Mean±SEM.n=6.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsMPP+group.

圖4 MPP+造模后第7天各組CX3CR1表達(dá)情況

雷公藤內(nèi)酯是中藥雷公藤中主要的單體成分，本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到雷公藤內(nèi)酯可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，降低TH陽(yáng)性神經(jīng)元的死亡率。這些研究結(jié)果與雷公藤內(nèi)酯可以抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活，保護(hù)DA神經(jīng)元相吻合[10-11]，印證了雷公藤內(nèi)酯有確切的小膠質(zhì)細(xì)胞抑制作用，可減輕TH神經(jīng)元的損傷。我們同時(shí)觀察到雷公藤內(nèi)酯可抑制CX3CR1的表達(dá)，提示CX3CR1可能是其抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的途徑之一。

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CX3CR1 mediates the neuroprotective effect of triptolide on 1-methyl-4-phenylpyridinium-induced hemiparkinson rats

ZHOU Zi-yi1, GAO Jun-peng2, XIANG Jun3, CHEN Yi-ping3, CAI Ye-feng1, LUO En-li1, CAI Ding-fang3

(1FirstDepartmentofNeurology,SecondAffiliatedHospital,GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120,China;2GuangzhouFirstPeople’sHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180,China;3LaboratoryforNeurologicalResearch,TheInstituteofIntegrativeMedicine,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China.E-mail:sciencecn@hotmail.com;doctorcn@hotmail.com)

AIM: To investigate the effect of triptolide on the inhibition of microglial activation in 1-methyl-4-phenyl pyridinium (MPP+)-induced hemiparkinson disease rats. METHODS: The rat model of Parkinson disease was established by intranigral injection of MPP+. The rats were randomly divided into sham group, MPP+group, triptolide group and vehicle group. The survival of dopaminergic neurons was detected by the immunofluorescence of tyrosine hydroxylase (TH) in the substantia nigra (SN). The activation of microglia was determined by immunofluorescence of OX-42 (microglia marker) in the SN. The expression of chemokine receptor CX3CR1 in SN was measured by Western blotting. RESULTS: Intranigral injection of MPP+increased the fluorescence intensity of the microglial marker, and promoted DA neuron degenerative death. Immunohistological analysis showed that the OX-42 density was decreased (P<0.01) and tyrosine hydroxylase (TH) positive neurons were increased in the triptolide group (P<0.01). The expression of CX3CR1 was lower in triptolide group than that in model group (P<0.05). CONCLUSION: Triptolide may improve PA neurons function in MPP+-induced rats through inhibiting CX3CR1 expression and microglial activation.

Parkinson’s disease; Microglia; Triptolide; Dopaminergic neuron

1000- 4718(2015)04- 0659- 05

2014- 10- 22

2014- 11- 27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81373712)

R363; R741

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.015

△通訊作者 羅恩麗 Tel: 020-81887233； E-mail: sciencecn@hotmail.com; 蔡定芳 Tel: 021-64041990; E-mail: doctorcn@hotmail.com

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