經(jīng)bcl-2基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)缺血性心功能不全兔心功能及血管新生的影響

高 青， 李樹仁， 荀麗穎， 苑可心， 謝悅陶， 張倩輝， 郝清卿， 黨 懿， 齊曉勇

(1河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院， 2河北省人民醫(yī)院心內(nèi)一科，河北 石家莊 050051)

?

經(jīng)bcl-2基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)缺血性心功能不全兔心功能及血管新生的影響

高 青1， 李樹仁2△， 荀麗穎2， 苑可心2， 謝悅陶2， 張倩輝2， 郝清卿2， 黨 懿2， 齊曉勇2

(1河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，2河北省人民醫(yī)院心內(nèi)一科，河北 石家莊 050051)

目的： 探討經(jīng)bcl-2基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植對(duì)急性心肌梗死家兔心肌細(xì)胞凋亡、血管再生及心功能的影響。方法: 體外分離、培養(yǎng)、純化兔BMSCs，分別轉(zhuǎn)染腺病毒及重組腺病毒-Bcl-2。結(jié)扎兔冠狀動(dòng)脈前降支制作心肌梗死(MI)模型，2周后于心梗邊緣區(qū)分別注射等量的腺病毒-Bcl-2-BMSCs(MI+Bcl-2-BMSCs組)、腺病毒-BMSCs(MI+BMSCs組)及DMEM液(MI組)。細(xì)胞移植4周后經(jīng)超聲測(cè)定心功能；熒光顯微鏡觀察BMSCs的存活及分布；TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡；real-time PCR檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá)；免疫組化染色法檢測(cè)CD31表達(dá)，計(jì)算新生毛細(xì)血管密度。以上數(shù)據(jù)分別與心功能進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果: 與MI組相比，MI+Bcl-2-BMSCs組和MI+BMSCs組的心功能改善、細(xì)胞凋亡率降低、VEGF mRNA表達(dá)增多、毛細(xì)血管密度增加，其中MI+Bcl-2-BMSCs組的變化更為顯著(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示左室射血分?jǐn)?shù)與心肌細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)；與VEGF mRNA的表達(dá)量及毛細(xì)血管密度呈正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論: 經(jīng)bcl-2基因修飾的BMSCs移植可顯著減少缺血性心功能不全兔心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管再生、改善心功能。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 基因治療； 心肌梗死；bcl-2基因

急性心肌梗死是一種嚴(yán)重危害人類身體健康的疾病。心肌梗死(myocardial infarction，MI)導(dǎo)致局部心肌組織發(fā)生不可逆的生物學(xué)變化，如心肌細(xì)胞壞死、凋亡，成纖維細(xì)胞增生，膠原蛋白過量堆積，心肌間質(zhì)纖維化等，最終引起心室重構(gòu)和缺血性心力衰竭的發(fā)生[1]。心肌梗死后有效的細(xì)胞替代及血運(yùn)重建對(duì)保護(hù)心臟功能,改善遠(yuǎn)期預(yù)后起關(guān)鍵作用。近年來有研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs)可促進(jìn)缺血心肌的功能恢復(fù)及改善左室重構(gòu)[2]，因此成為細(xì)胞移植治療心肌梗死的常用干細(xì)胞類型之一。然而移植細(xì)胞在缺血缺氧心肌微環(huán)境中常發(fā)生大量的凋亡，嚴(yán)重影響干細(xì)胞療效。bcl-2作為一種抗凋亡基因，可從多個(gè)水平抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究探討采用bcl-2基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)急性心肌梗死家兔心肌細(xì)胞凋亡、血管再生、心功能的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康3月齡新西蘭雄兔共30只，體重約2.5～3.0 kg，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。其中2只作為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的供體，28只作為移植的受體。

2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因及bcl-2基因的腺病毒載體(Ad-EGFP-Bcl-2)、含EGFP基因的腺病毒載體(Ad-EGFP)(本課題組前期構(gòu)建留存)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Roche)；小鼠抗兔CD31單抗、山羊抗小鼠IgG II 抗試劑盒(Abcam)；Percoll 細(xì)胞分離液(Pharmacia)；低糖型DMEM(HyClone)；DAPI(Sigma)；TRIzol Reagent(Invitrogen)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)；熒光定量PCR試劑盒(BBI)；隨機(jī)引物(Promega)；PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；心臟超聲儀(Vivid I)；7300 實(shí)時(shí)定量 PCR 儀(ABI)；熒光倒置相差顯微鏡(Leica)。

3 方法

3.1 BMSCs的分離、培養(yǎng)、純化 無菌條件下用骨穿針抽取兔股骨及脛骨處骨髓液共4～5 mL，與肝素混勻，1.073 kg/L Percoll 細(xì)胞分離液密度梯度離心+貼壁培養(yǎng)法分離、純化BMSCs，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)用0.25%的胰酶消化，按1∶2比例傳代培養(yǎng)[3]。于倒置相差顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)特征。

3.2 重組腺病毒載體的構(gòu)建 重組腺病毒Ad-EGFP-Bcl-2、Ad-EGFP均由本課題組前期構(gòu)建留存[4]，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)目的基因的表達(dá)，測(cè)序鑒定目的基因片段正確性。病毒擴(kuò)增后置于-80 ℃保存(病毒滴度為T=2.5×1013PFU/L)。

3.3 重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第9代BMSCs，消化后以3×108/L的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，于培養(yǎng)瓶中加入無血清培養(yǎng)基1 mL，再加入含Ad-EGFP-Bcl-2或Ad-EGFP的病毒液(MOI=500)轉(zhuǎn)染BMSCs，轉(zhuǎn)染2 h內(nèi)每隔15 min搖晃1次。2 h后棄轉(zhuǎn)染的病毒液，以PBS沖洗后加入含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后經(jīng)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，測(cè)定最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI)。

3.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模 將28只健康新西蘭家兔按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為MI+Bcl-2-BMSCs組(n=9)、MI+BMSCs組(n=10)和MI組(n=9)。采用開胸結(jié)扎兔冠狀動(dòng)脈前降支的方法制作急性心肌梗死后心功能不全模型。將家兔仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，連接針形電極至皮下1 cm，記錄心電圖檢查結(jié)果。常規(guī)消毒、鋪巾，3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉(1 mL/kg)。剪開胸部左側(cè)皮膚，鈍性分離皮下組織及肌肉至肋骨。沿胸骨左緣切斷第3、4、5肋骨，放置開胸器暴露并打開心包，暴露左冠狀動(dòng)脈前降支，于第1對(duì)角支近端處用絲線結(jié)扎前降支(建模成功標(biāo)準(zhǔn)為心尖部及部分左室前壁心肌由紅色變?yōu)榘底仙?，局部心肌收縮力減弱，心電圖檢查示ST段呈持續(xù)弓背向上性抬高[5-6])，最后逐層關(guān)胸。

3.5 細(xì)胞移植 造模2周后，收集1×107個(gè)細(xì)胞用DMEM濃縮至1 mL。再次開胸開通結(jié)扎的冠狀動(dòng)脈，選取心肌梗死邊緣區(qū)域4個(gè)注射點(diǎn)，采用心肌注射的方法各組分別注射細(xì)胞懸液Ad-EGFP-Bcl-2-BMSCs(MI+Bcl-2-BMSCs組)和 Ad-EGFP-BMSCs(MI+BMSCs組)及DMEM液(MI組)(每點(diǎn)各注射0.25 mL)。術(shù)后3 d每天肌注青霉素8×105U預(yù)防感染。

3.6 超聲影像技術(shù)檢測(cè)心功能 采用Vivid I心臟超聲儀在術(shù)前、術(shù)后2周及細(xì)胞移植后4周由同一?？漆t(yī)生行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，測(cè)量各組左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricle ejection fraction，LVEF)及左室短軸縮短率(left ventricle fractional shortening，LVFS)，所有測(cè)量值均取3次測(cè)量的平均值。

3.7 免疫組化法染色并計(jì)算新生毛細(xì)血管密度 細(xì)胞移植4周后處死動(dòng)物，剪開心包膜，暴露心臟，迅速取下心臟，冰生理鹽水沖洗，切取梗死邊緣區(qū)心肌組織，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。將留取的心肌組織制成 6 μm厚冰凍切片，熒光顯微鏡觀察移植細(xì)胞存活情況。剩余心肌組織，用4%多聚甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋后制成厚約5 μm的切片，HE染色后光鏡觀察組織學(xué)形態(tài)變化。采用卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)法，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記抗體CD31進(jìn)行染色。石蠟切片脫蠟至水，經(jīng)熱修復(fù)、3% H2O2去離子水孵育和山羊血清封閉后，滴加小鼠抗兔CD31 I 抗(1∶50)4 ℃過夜。室溫下分別滴加山羊抗小鼠IgG II抗及辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素(S-A/HRP)孵育。DAB顯色，常規(guī)復(fù)染、脫水、中性樹膠封片。陽性血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)經(jīng)染色呈棕褐色，根據(jù)染色結(jié)果于顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)各組毛細(xì)血管數(shù)目，每張切片選5個(gè)梗死邊緣區(qū)心肌組織中血管密度最高處，取平均單個(gè)視野(×100)血管數(shù)為毛細(xì)血管密度。將所得的新生毛細(xì)血管密度與LVEF進(jìn)行相關(guān)性分析。

3.8 原位缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測(cè)心肌凋亡細(xì)胞 按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，并設(shè)陰性對(duì)照組 (TUNEL 反應(yīng)液中不加 TdT)。光鏡下可觀察到正常心肌細(xì)胞核染成藍(lán)色,凋亡心肌細(xì)胞核染成棕褐色。凋亡率的計(jì)算：隨機(jī)選取梗死邊緣區(qū)心肌組織中5個(gè)非重疊視野(×200)，計(jì)數(shù)凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)，心肌細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100 % 。將所得的心肌細(xì)胞凋亡率與LVEF進(jìn)行相關(guān)性分析。

3.9 Real-time PCR法檢測(cè)心肌組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) mRNA的表達(dá) 取50 mg心梗邊緣區(qū)心肌組織進(jìn)行研磨，提取總RNA，瓊脂糖凝膠檢測(cè)其完整性；按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。引物序列: GAPDH的上游引物為5’-CAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3’，下游引物為5’-CACTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為 92 bp[5-6]；VEGF的上游引物為5’-GTGGACATCTTCCAGGAGTACC-3’, 下游引物為5’-GATCCGCATGATCTGCATGGTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為153 bp。將獲得的cDNA按照熒光定量PCR試劑盒操作說明書方法擴(kuò)增目的基因，PCR熱循環(huán)參數(shù)為96 ℃ 4 min，然后3步反應(yīng)：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。以 GAPDH 為內(nèi)參照，將目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值用于統(tǒng)計(jì)分析。Real-time PCR 采用2-ΔΔCt(ΔCt=目的基因 Ct值-GAPDH Ct值，ΔΔCt=目的基因ΔCt 值-內(nèi)參照基因ΔCt 值)法統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果[7]。將所得的VEGF mRNA的表達(dá)量與LVEF進(jìn)行相關(guān)性分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析(one-way ANVOVA)，多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)變量間采用直線相關(guān)分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BMSCs的形態(tài)觀察

骨髓液經(jīng)Percoll分離液密度梯度離心后，取白色絮狀物層接種于培養(yǎng)瓶，24～48 h后觀察到散在貼壁的紡錘狀BMSCs，7～10 d時(shí)BMSCs呈長(zhǎng)梭狀，部分呈三角或多角形，細(xì)胞間形成突起，胞核居中，細(xì)胞排列疏松。18～21 d可見形態(tài)規(guī)則的單層融合束狀貼壁細(xì)胞，排列緊密呈漩渦狀、放射狀。采用胰蛋白酶消化融合的BMSCs，以1∶2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，24 h后細(xì)胞完全貼壁，3～5 d后即達(dá)80%融合。傳至第10代時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢。

2 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞

病毒轉(zhuǎn)染24～48 h后，于熒光顯微鏡下觀察到帶有EGFP標(biāo)記的BMSCs，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭狀，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定MOI值為500時(shí)轉(zhuǎn)染效率最佳。

3 心肌梗死后心功能不全造模的結(jié)果

28只新西蘭雄兔接受造模手術(shù)，術(shù)后共有24只存活，其中MI+Bcl-2-BMSCs組存活8只，死亡1只；MI+BMSCs組存活8只，死亡2只；MI組存活8只，死亡1只。共死亡4只，其中，2只于結(jié)扎前降支過程中因誘發(fā)室顫死亡，1只造模后因呼吸驟停死亡，1只于2次開胸細(xì)胞移植后48 h死亡。

4 心臟超聲影像學(xué)的檢查結(jié)果

造模前將各組新西蘭雄兔行心臟超聲影像學(xué)檢查，各組兔心功能指標(biāo)均正常，并于造模后2周(即移植前)及細(xì)胞移植后4周，再次行超聲檢查。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理發(fā)現(xiàn)，術(shù)前及術(shù)后2周各組間LVEF、LVFS均無明顯差異(P>0.05)；BMSCs 移植后4周，MI+Bcl-BMSCs組和MI+BMSCs組的LVEF值及LVFS值與MI組相比均升高, 其中MI+Bcl-2-BMSCs組的LVEF值、LVFS值又明顯高于MI+BMSCs組及MI組；并且細(xì)胞移植4周后，MI+Bcl-2-BMSCs組和MI+BMSCs組的LVEF值及LVFS值均較移植前升高，其中以MI+Bcl-2-BMSCs組的LVEF值及LVFS值升高的更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The comparison of LVEF and LVFS in different groups 4 weeks after transplantation. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsMI;#P<0.05vsMI+BMSCs.

圖1 移植后4周各組LVEF及LVFS的比較

5 熒光顯微鏡下觀察移植細(xì)胞的存活

細(xì)胞移植后4周，處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，切取梗死邊緣

區(qū)心肌組織，制作冰凍切片，于熒光顯微鏡下觀察，MI+Bcl-2-BMSCs組與MI+BMSCs組可見帶有EGFP標(biāo)記的移植BMSCs，并且MI+Bcl-2-BMSCs組EGFP表達(dá)高于MI+BMSCs組, MI組未見到綠色熒光，見圖2。

6 病理學(xué)檢查

切取正常及梗死邊緣區(qū)心肌組織，經(jīng)石蠟包埋、切片、HE染色后，于光鏡下觀察，可見正常心肌細(xì)胞形態(tài)均一、排列整齊。細(xì)胞質(zhì)染色均勻，成淡藍(lán)色，胞核大小一致，呈橢圓形或圓形，居胞質(zhì)中央。梗死區(qū)域的心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌纖維斷裂，細(xì)胞間可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。各組梗死邊緣區(qū)心肌組織與正常心肌組織比較可發(fā)現(xiàn): MI+Bcl-2-BMSCs組病理學(xué)改變較輕微，MI+BMSCs組其次，MI組較嚴(yán)重。

Figure 2.BMSCs labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP) in infarction marginal zone (×40). EGFP expression is indicated by red arrows.

圖2 梗死邊緣區(qū)心肌組織中增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的BMSCs

7 細(xì)胞凋亡及其與心功能的關(guān)系

經(jīng)TUNEL染色后，光鏡下觀察可見3組均存在染色陽性的凋亡細(xì)胞(染色質(zhì)濃縮、邊集呈棕褐色，核膜裂解，可見染色質(zhì)被分割成顆粒狀即凋亡小體)。陰性對(duì)照組細(xì)胞核均呈藍(lán)色。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，MI+Bcl-2-BMSCs組的凋亡率較MI+BMSCs組顯著降低(P<0.05)，而MI+BMSCs組的細(xì)胞凋亡率又明顯低于MI組，見圖3、表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后左室射血分?jǐn)?shù)與心肌細(xì)胞的凋亡率呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

8 血管新生情況及其與心功能的關(guān)系

細(xì)胞移植后4周，將各組石蠟切片經(jīng)過CD31免疫組化染色，于光鏡下觀察，各組梗死邊緣區(qū)心肌組織可見染色陽性的棕褐色血管內(nèi)皮細(xì)胞，MI+Bcl-2-BMSCs組毛細(xì)血管密度明顯高于MI+BMSCs組(P<0.05)；而 MI+BMSCs組又顯著高于MI組(P<0.05)，見圖4、表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后左室射血分?jǐn)?shù)與梗死邊緣區(qū)新生毛細(xì)血管密度呈正相關(guān)(P<0.01)。

Figure 3.Apoptosis of myocardial cells in infarction marginal zone measured by TUNEL (×200). The apoptotic cells are indicated by red arrows.

圖3 梗死邊緣區(qū)心肌組織TUNEL染色

表1 各組兔心肌梗死邊緣區(qū)細(xì)胞凋亡率、新生血管密度及VEGF mRNA表達(dá)量的比較

Table 1.The levels of cardiocyte apoptosis rate, neovascular density and VEGF mRNA expression in infarction marginal zone (Mean±SD.n=8)

GroupApoptoticrate(%)NeovasculardensityVEGFmRNAexpressionMI63.38±8.526.88±2.030.64±0.19MI+BMSCs44.14±5.99*14.38±2.92*0.99±0.17*MI+Bcl-2-BMSCs30.75±5.65*#24.25±3.46*#1.64±0.29*#

*P<0.05vsMI;#P<0.05vsMI+BMSCs.

Figure 4.CD31 immunohistochemical staining of neovascular in infarction marginal zone (×100). The neovasculars are indicated by red arrows.

圖4 心肌梗死邊緣區(qū)新生血管CD31免疫組化染色

9 心肌梗死邊緣區(qū)組織VEGF mRNA表達(dá)與心功能的關(guān)系

通過real-time PCR法測(cè)定心肌梗死邊緣區(qū)組織中的VEGF表達(dá)量，檢測(cè)結(jié)果表明MI+Bcl-2-BMSCs組VEGF mRNA表達(dá)量明顯高于MI+BMSCs組(P<0.05)，而后者又明顯高于MI組(P<0.05)，見圖5、表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后左室射血分?jǐn)?shù)與梗死邊緣區(qū)心肌組織中VEGF的mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)(P<0.01)。

討 論

傳統(tǒng)的藥物治療、冠脈介入治療及外科手術(shù)治療雖然廣泛開展，但僅能有限地緩解癥狀而不能從根源上解決心肌細(xì)胞缺失的問題，心肌梗死后心衰的發(fā)生率及死亡率仍不斷升高[8]。干細(xì)胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能未分化的細(xì)胞，因其具有較好細(xì)胞修復(fù)、替代和再生潛能，迅速成為心血管疾病治療的新方法。干細(xì)胞種類繁多，經(jīng)大量的相關(guān)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，骨髓源性干細(xì)胞因其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，受到研究者的重視[9]。

Figure 5.The level of VEGF mRNA in different groups. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsMI;#P<0.05vsMI+BMSCs.

圖5 各組心肌梗死邊緣區(qū)VEGF mRNA表達(dá)量的比較

干細(xì)胞在治療心肌梗死方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，然而移植后的干細(xì)胞在缺血、缺氧等惡劣環(huán)境下極低的存活率限制了其發(fā)展[10]。為此，人們嘗試基因修飾的方法，即在細(xì)胞移植前將抗凋亡基因通過轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，使基因結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而從根源上解決干細(xì)胞的存活、代謝、增生或分化等能力。目前用于干細(xì)胞轉(zhuǎn)染治療缺血性心肌病研究的目的基因種類繁多，其中尤以抗凋亡基因頗受關(guān)注。研究表明，將Pim-1、GSK-3b或組織型激肽釋放酶(tissue kallikrein，TK)等抗凋亡基因修飾的細(xì)胞移植到體內(nèi)后均可使細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞的生存力增強(qiáng)[11-13]。

理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法應(yīng)具備操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率最高的方法，且同時(shí)具有細(xì)胞毒性低的優(yōu)勢(shì)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用腺病毒轉(zhuǎn)染干細(xì)胞的方法，將目的基因bcl-2成功轉(zhuǎn)染至BMSCs內(nèi)，實(shí)驗(yàn)中未見明顯毒副作用的發(fā)生，且轉(zhuǎn)染效率高。

bcl-2是抗凋亡基因家族的一員，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，線粒體是其調(diào)控內(nèi)在凋亡途徑的靶點(diǎn),主要作用于線粒體外膜[14]，通過蛋白-蛋白相互作用形成異源或同源多聚體進(jìn)而調(diào)節(jié)孔隙形成蛋白來發(fā)揮作用[15-16]。Li等[17]應(yīng)用抗凋亡基因bcl-2修飾BMSCs后，觀察到在體外低氧環(huán)境下經(jīng)修飾后的BMSCs抗凋亡能力增強(qiáng)，同時(shí)VEGF分泌增多，移植體內(nèi)后存活細(xì)胞數(shù)目顯著增加，且心功能的改善更為顯著。

本實(shí)驗(yàn)以腺病毒為載體，將bcl-2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入BMSCs，通過增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的表達(dá)來分別示蹤2組BMSCs(重組EGFP-腺病毒載體可高效感染骨髓間質(zhì)干細(xì)胞[18]，并且不會(huì)影響B(tài)MSCs的分化及旁分泌機(jī)能[19-20])，細(xì)胞移植前于熒光顯微鏡下觀察到MI+Bcl-2-BMSCs組及MI+BMSCs組均可見EGFP標(biāo)記的綠色熒光蛋白在干細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，說明攜帶bcl-2基因及空載的腺病毒均已成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)。應(yīng)用心肌內(nèi)注射的方法將轉(zhuǎn)染成功的各組干細(xì)胞分別移植入造模成功的心肌內(nèi)，細(xì)胞移植后4周處死動(dòng)物，留取梗死邊緣區(qū)心肌組織，制備組織切片，再次于熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MI+Bcl-2-BMSCs組及MI+BMSCs組仍可見EGFP標(biāo)記的綠色熒光蛋白的表達(dá)，且前者明顯多于后者，MI組則始終未見綠色熒光出現(xiàn)。說明移植的BMSCs可在梗死邊緣區(qū)心肌組織內(nèi)存活，且MI+Bcl-2-BMSCs組的BMSCs存活數(shù)量較MI+BMSCs組明顯增多。經(jīng)TUNEL法對(duì)心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MI+Bcl-2-BMSCs組較MI+BMSCs組的細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少，而后者又明顯低于MI組。說明BMSCs可使心肌梗死邊緣區(qū)的部分缺血心肌細(xì)胞凋亡減少，而轉(zhuǎn)染了bcl-2基因的BMSCs該作用更明顯。超聲影像學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)最終各組心功能產(chǎn)生了差異性變化，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)，梗死邊緣區(qū)心肌組織內(nèi)細(xì)胞的凋亡率與心功能LVEF之間呈明確負(fù)相關(guān)關(guān)系。

此外，本研究還對(duì)各組心肌梗死邊緣區(qū)的組織切片進(jìn)行了免疫組織化學(xué)CD31染色，發(fā)現(xiàn)在該區(qū)有大量染色陽性(呈棕褐色)的血管內(nèi)皮細(xì)胞存在，提示該區(qū)域存在血管新生，微循環(huán)豐富。并且MI+Bcl-2-BMSCs組染色陽性的毛細(xì)血管較MI+BMSCs組及MI組明顯增加，同時(shí)在細(xì)胞移植4周后MI+Bcl-2-BMSCs組VEGF mRNA的表達(dá)量較MI+BMSCs組也明顯增加，心功能明顯改善，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)，VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量及新生毛細(xì)血管數(shù)與心功能LVEF之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。由此我們推測(cè)bcl-2基因修飾BMSCs移植改善心功能的可能機(jī)制為bcl-2基因的導(dǎo)入抑制了部分BMSCs的凋亡，使最終移植后BMSCs的存活量增加；而移植到心肌梗死邊緣區(qū)局部的BMSCs除了自身定向分化為心肌細(xì)胞，增加了功能性心肌細(xì)胞的數(shù)量外，同時(shí)BMSCs還通過某種分泌方式產(chǎn)生VEGF等細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)梗死邊緣區(qū)心肌組織內(nèi)毛細(xì)血管再生，改善局部微循環(huán)，最終導(dǎo)致了心功能的改善。同樣，國(guó)外學(xué)者也有類似的報(bào)道，他們發(fā)現(xiàn)移植后的BMSCs與內(nèi)皮細(xì)胞間存在聯(lián)分泌及旁分泌樣地相互作用[21]，而移植后的BMSCs將通過該方式產(chǎn)生多種促血管生成因子，營(yíng)造促進(jìn)血管再生的微環(huán)境[22-23]。這可能是心肌梗死后BMSCs促使局部心肌組織血管生成增加及心功能改善的內(nèi)在機(jī)制。然而最終心功能的改善是否僅與分泌機(jī)制相關(guān)的微循環(huán)改善有關(guān)，干細(xì)胞是否還可分泌其它種類的細(xì)胞因子，或者是通過分泌機(jī)制以外的其它方式發(fā)揮功能，這些問題都有待我們進(jìn)一步驗(yàn)證。

終上所述，經(jīng)Bcl-2基因修飾的BMSCs移植可較單純BMSCs移植更顯著地減少心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管再生、改善心功能。本實(shí)驗(yàn)為臨床心肌梗死的治療提供了新思路，諸多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所取得的成就也肯定了干細(xì)胞巨大的發(fā)展?jié)摿?，然而基因修飾干?xì)胞應(yīng)用于臨床前還存在許多問題亟待解決[24]，例如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所取得進(jìn)展能否在臨床復(fù)制、該療效是否可以長(zhǎng)期維持、移植后遠(yuǎn)期安全性問題以及干細(xì)胞分離方法、基因轉(zhuǎn)染的載體選擇、細(xì)胞移植途徑及數(shù)量的進(jìn)一步標(biāo)化等。相信隨著該領(lǐng)域研究的不斷深入，基因修飾干細(xì)胞移植將被廣泛應(yīng)用于臨床。

[1] van den Borne SW, Diez J, Blankesteijn WM, et al. Myocardial remodeling after infarction: the role of myofibroblasts[J]. Nat Rev Cardiol, 2010, 7(1):30-37.

[2] Williams AR, Trachtenberg B, Velazquez DL, et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling[J]. Circ Res, 2011, 108(7):792-796.

[3] Alhadlaq A, Mao JJ. Mesenchymal stem cells: isolation and therapeutics[J]. Stem Cells Dev, 2004, 13(4):436-448.

[4] 王 曼. 經(jīng)Bcl-2修飾的同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)兔心梗后心功能不全的影響[D]. 石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2014.

[5] 胡 煒，李樹仁，張素巧，等. 自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)心肌梗死后兔Ryanodine受體及其穩(wěn)定蛋白表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2012, 32(01):110-113.

[6] 喬建晶，李樹仁，胡 煒，等. 自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)心肌梗死后心衰家兔炎性因子表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2011, 31(11):2048-2051.

[7] Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method[J]. Nat Protoc, 2008, 3(6):1101-1108.

[8] Velagaleti RS, Pencina MJ, Murabito JM,et al. Long-term trends in the incidence of heart failure after myocardial infarction[J]. Circulation, 2008, 118( 20) : 2057-2062.

[9] Clifford DM, Fisher SA, Brunskill SJ, et al. Stem cell treatment for acute myocardial infarction[J]. Cochrane Database Syst Rev, 2012, 2:CD006536.

[10]Hoover-Plow J, Gong Y. Challenges for heart disease stem cell therapy[J]. Vasc Health Risk Manag, 2012,8:99-113.

[11]Quijada P, Toko H, Fischer KM, et al. Preservation of myocardial structure is enhanced by pim-1 engineering of bone marrow cells[J]. Circ Res, 2012, 111(1):77-86.

[12] Cho J, Zhai P, Maejima Y, et al. Myocardial injection with GSK-3β-overexpressing bone marrow-derived mesenchymal stem cells attenuates cardiac dysfunction after myocardial infarction[J]. Circ Res, 2011, 108(4):478-489.

[13]Gao L, Bledsoe G, Yin H, et al. Tissue kallikrein-modified mesenchymal stem cells provide enhanced protection against ischemic cardiac injury after myocardial infarction[J]. Circ J, 2013, 77(8):2134-2144.

[14]Ola MS, Nawaz M, Ahsan H. Role of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosis[J]. Mol Cell Biochem, 2011, 351(1-2): 41-58.

[15]Lindsay J, Esposti MD, Gilmore AP. Bcl-2 proteins and mitochondria-specificity in membrane targeting for death[J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1813(4):532-539.

[16]Korytowski W, Basova LV, Pilat A, et al. Permeabilization of the mitochondrial outer membrane by Bax/truncated Bid (tBid) proteins as sensitized by cardiolipin hydroperoxide translocation mechanistic implications for the intrinsic pathway of oxidative apoptosis[J]. J Biol Chem, 2011, 286(30):26334-26343.

[17]Li W, Ma N, Ong LL,et al. Bcl-2 engineered MSCs inhibited apoptosis and improved heart function[J]. Stem Cells, 2007, 25(8):2118-2127.

[18]李紅樂，邢飛躍，孫學(xué)剛，等. 腺病毒介導(dǎo)的EGFP基因在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的高效表達(dá)[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2003, 19 (3) :293-296.

[19]Gheisari Y, Azadmanesh K, Ahmadbeigi N, et al. Genetic modification of mesenchymal stem cells to overexpress CXCR4 and CXCR7 does not improve the homing and therapeutic potentials of these cells in experimental acute kidney injury[J]. Stem Cells Dev, 2012, 21(16):2969-2980.

[20]Liu N, Zhang Y, Fan L, et al. Effects of transplantation with bone marrow-derived mesenchymal stem cells modified by survivin on experimental stroke in rats[J]. Transl Med, 2011, 9:105.

[21]Rahbarghazi R, Nassiri SM, Khazraiinia P, et al. Juxtacrine and paracrine interactions of rat marrow-derived mesenchymal stem cells, muscle-derived satellite cells, and neonatal cardiomyocytes with endothelial cells in angiogenesis dynamics[J]. Stem Cells Dev, 2013, 22(6):855-865.

[22]余其貴，王 永，吳繼雄. 自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植心肌梗死區(qū)后細(xì)胞因子分泌和血管新生及心肌細(xì)胞凋亡的變化[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2008, 12(16):3001-3005.

[23]Rahbarghazi R, Nassiri SM, Ahmadi SH, et al. Dynamic induction of pro-angiogenic milieu after transplantation of marrow-derived mesenchymal stem cells in experimental myocardial infarction[J]. Int J Cardiol, 2014, 173(3):453-466.

[24]葛均波，黃浙勇. 干細(xì)胞治療急性心肌梗死：離臨床應(yīng)用還有多遠(yuǎn)?[J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2011, 31(10):739-742.

Transplantation of bcl-2 gene-modified bone marrow mesenchymal stem cells improves cardiac function and angiogenesis in rabbit ischemic car-diac insufficiency model

GAO Qing1, LI Shu-ren2, XUN Li-ying2, YUAN Ke-xin2, XIE Yue-tao2, ZHANG Qian-hui2, HAO Qing-qing2, DANG Yi2, QI Xiao-yong2

(1GraduateSchoolofHebeiMedicalUniversity,2DepartmentofCardiology,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China.E-mail:lsr64@126.com)

AIM: To investigate the effects of transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) modified bybcl-2 gene on myocardial cell apoptosis, angiogenesis and cardiac function in the rabbit after acute myocardial infarction (MI). METHODS: The rabbit BMSCs were isolated, cultured and purifiedinvitro. The BMSCs were transfected with adenovirus or adenovirus-Bcl-2. The rabbit model of MI was established by ligation of left anterior descending branch. The rabbits were injected with Ad-Bcl-2-BMSCs (MI+Bcl-2-BMSCs group), Ad-BMSCs (MI+BMSCs group) and DMEM (MI group) in infarction marginal zone 2 weeks after ligation. The cardiac function was evaluated by echocardiography.The apoptosis of myocardial cells was measured by TUNEL. The mRNA expression of VEGF was detected by real-time PCR. The expression of CD31 was examined by immunohistochemical staining, and new blood capillaries were counted at 4 weeks after BMSCs transplantation. The correlation of the above values with cardiac function was analyzed. RESULTS: The cardiac function was better, the apoptotic rate was lower, the mRNA expression of VEGF and the capillary density were higher in both MI+Bcl-2-BMSCs group and the MI+BMSCs group than those in MI group, and those in MI+Bcl-2-BMSCs group increased more obviously .The left ventricular ejection fraction (LVEF) had a negative correlation with the myocardial cell apoptosis rate. A positive correlation with the mRNA expression level of VEGF and the capillary density was also observed. CONCLUSION: The transplantation of BMSCs modified bybcl-2 gene significantly reduces the myocardial cell apoptosis, promotes angiogenesis, improves heart function of the rabbits with MI.

Bone marrow mesenchymal stem cells; Gene therapy; Myocardial infarction;bcl-2 gene

1000- 4718(2015)04- 0640- 07

2014- 11- 13

2015- 01- 07

R363; R541.4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.012

△通訊作者 Tel: 0311-85988732； E-mail: lsr64@126.com