柚皮苷對高糖誘導的血管內皮細胞損傷及PI3K/AKT/eNOS信號通路的影響*

儲佳佳， 李積東， 雷 霖， 孔 瀅， 李 騰， 嚴國強， 沈小丹， 溫見炳， 黃起壬△

(1江西省基礎藥理學重點實驗室， 2南昌大學藥學院藥理學教研室，江西 南昌 330006； 3宜春市公安局刑事科學技術研究所，江西 宜春 336000)

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柚皮苷對高糖誘導的血管內皮細胞損傷及PI3K/AKT/eNOS信號通路的影響*

儲佳佳1, 2▲， 李積東1,2▲， 雷 霖3， 孔 瀅1, 2， 李 騰1, 2， 嚴國強1, 2， 沈小丹1, 2， 溫見炳1, 2， 黃起壬1, 2△

(1江西省基礎藥理學重點實驗室，2南昌大學藥學院藥理學教研室，江西 南昌 330006；3宜春市公安局刑事科學技術研究所，江西 宜春 336000)

目的： 研究柚皮苷(naringin，Nar)對高糖(high glucose，HG)誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)損傷的作用及對PI3K/AKT/eNOS信號通路的影響。方法: 利用 HG(33 mmol/L glucose)培養(yǎng)基孵育HUVECs不同時間(6、12、24、48、72 h)后，用胰島素(5 mIU/L)刺激細胞15 min，建立內皮細胞損傷模型，分別測定各組上清液中NO水平、細胞中eNOS和磷酸化eNOS(p-eNOS)的水平。對損傷的HUVECs用不同濃度的Nar (5、10、25、50、100 mg/L)孵育不同時間(6、12、24、48和72 h)，用胰島素(5 mIU/L)刺激細胞15 min， 檢測細胞上清中的NO水平，觀察Nar對HG誘導HUVECs 損傷的作用。對損傷細胞先分別用PI3K抑制劑LY294002(10 μmol/L)和AKT抑制劑AKT inhibitor Ⅳ(0.5 μmol/L)預處理24 h，再用50 mg/L的Nar處理24 h，用胰島素(5 mIU/L)刺激細胞15 min，檢測細胞上清中NO的水平，以及 eNOS、p-eNOS、PI3K、AKT及p-AKT的蛋白水平，探討Nar減輕HG對HUVECs 損傷作用的機制。結果: Nar的量效和時效結果顯示，50 mg/L Nar預處理HUVECs 24 h后，其減輕HG對HUVECs 損傷的作用最為顯著，表現(xiàn)為NO和p-eNOS的水平升高(P<0.05)。加入PI3K和AKT抑制劑后，Nar減輕HG致內皮細胞的損傷及上調p-eNOS和NO水平的作用完全取消(P<0.05)。結論: Nar能減輕HG誘導的血管內皮細胞損傷，其作用機制可能是通過PI3K/AKT/eNOS信號通路介導的。

人臍靜脈內皮細胞； 高糖； 柚皮苷； 內皮型一氧化氮合酶

血管內皮是血液和血管壁之間的機械屏障，維持血管壁的完整性，也是全身最大的內分泌器官，可分泌多種血管活性物質，如內皮素(endothelin，ET)，一氧化氮(nitric oxide，NO)等，從而調節(jié)血管的舒縮功能。但是吸煙、高脂血癥、高血糖和高血壓等心血管危險因素持續(xù)損傷血管內皮，從而產生了諸多心腦血管疾病[1-2]。因此，在血管內皮損傷時積極干預治療，防止或延緩心血管疾病的發(fā)生發(fā)展尤為重要。

經研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷(naringin，Nar)為二氫異黃酮類化合物，具有明顯的抗炎、抗氧化應激、改善胰島素抵抗、調節(jié)糖類脂肪代謝等多種藥理學作用[3]；并且可有效地降低高糖(high glucose，HG)誘導的血管內皮炎癥損傷[4]。但其保護血管內皮免于損傷的作用機制尚未完全闡明。因血管內皮細胞功能紊亂與PI3K/AKT/eNOS通路受到抑制有關[5]。因此，本研究擬探討Nar是否是通過PI3K/AKT/eNOS/NO信號通路，從而有效減輕HG致內皮損傷的程度。

材 料 和 方 法

1 主要的試劑和儀器

Nar(中國成都西亞試劑有限公司)；AKT inhibitor Ⅳ(Calbiochem)；PI3K 抑制劑LY294002 (Sigma)；人臍靜脈內皮細胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購于ATCC；H-DMEM、L-DMEM和胎牛血清(HyClone)；β-actin多克隆抗體(中國北京中杉金橋生物技術有限公司)；p-eNOS、eNOS、AKT、p-AKT和PI3K單克隆抗體(CST)；NO檢測試劑盒(中國南京建成生物工程研究所)；酶標儀(Bio-Rad)。

2 高糖誘導HUVECs損傷模型的建立

將HUVECs接種于6孔板上，待細胞長至90%的融合度后，換液；加入HG (33 mmol/L glucose) 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2孵箱中孵育細胞不同時間(6、12、24、48和72 h)后換成無血清無雙抗的PBS過夜，再用胰島素(5 mIU/L)刺激細胞15 min，最后分別收集細胞上清液和細胞。上清液用于檢測HG處理前和高糖處理后各時點的NO水平；細胞用于檢測eNOS和p-eNOS水平。

3 Nar的最佳濃度和最佳孵育時間的確定

將培養(yǎng)的HUVECs接種于6孔板上，待細胞融合了90%后，除了正常(control, Ctrl)組，其它各組均用高糖誘導，為高糖(HG)組，并分別加入不同濃度的Nar(0、10、25、50、100 mg/L)孵育24 h后換成無血清無雙抗的PBS過夜，再用胰島素(5 mIU/L)刺激細胞15 min，收集上清，檢測培養(yǎng)基上清中的NO水平，以確定Nar最佳的的孵育濃度。再用已篩選出的最佳濃度的Nar，分別處理細胞6、12、24、36和48 h，正常組則加入等體積的DMSO孵育后，換成無血清無雙抗的PBS過夜，再用胰島素(5 mIU/L)刺激細胞15 min，檢測各時點細胞上清液中NO水平。

4 分組給藥

實驗共分5組。除了Ctrl組，其它4組均用HG孵育48 h成損傷模型后，各實驗組分別加入DMSO、Nar(50 mg/L)、 10 μmol/L LY294002[6]+ Nar、0.5 μmol/L AKT inhibitor Ⅳ[7]+ Nar，孵育24 h后換成無血清無雙抗的PBS過夜，再用胰島素(5 mIU/L)刺激細胞15 min，檢測培養(yǎng)基上清中的NO水平。用Western blot檢測HUVECs的eNOS、p-eNOS、PI3K、AKT及p-AKT蛋白的水平。

5 培養(yǎng)上清液中NO水平的檢測

參照南京建成生物工程研究所NO檢測試劑盒的使用說明，先做出標準曲線，然后根據(jù)各組吸光度，計算出各組NO的水平。

6 Western blotting檢測eNOS、p-eNOS、PI3K、AKT及p-AKT蛋白的水平

HUVECs處理后，經PBS清洗后，用RIPA裂解液進行裂解，蛋白濃度用BCA試劑盒進行測定，細胞裂解物溶于上樣緩沖溶液后經10%的SDS-PAGE分離，并電轉到PVDF膜上，取出后將膜放入5%脫脂牛奶或者5% BSA封閉中，封閉2 h，再用TBST洗膜3次，每次15 min。將PVDF膜放入相應 I 抗中(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST沖洗膜后，將膜放入相應的 II 抗(1∶2 000)中，室溫平搖2 h后，漂洗3次，每次20 min，用ECL化學發(fā)光法進行檢測。將曝光條帶進行X光膠片掃描后，在醫(yī)學圖形分析系統(tǒng)Image Tool軟件上進行灰度分析。結果以目的蛋白條帶的綜合密度分別除以對應組β-actin條帶的綜合密度所得的倍數(shù)表示。

7 統(tǒng)計學處理

各實驗組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，采用系統(tǒng)統(tǒng)計軟件 SPSS 17.0進行方差齊性檢驗，方差齊的各組采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 高糖誘導不同時間對NO、eNOS和p-eNOS水平的影響

用HG(33 mmol/L glucose)誘導48 h和72 h后，NO和p-eNOS水平顯著下降(P<0.01)；但是誘導48 h和72 h兩者之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，所以選定48 h為誘導內皮損傷的最佳時間，見圖1。

Figure 1.The HUVECs were treated with HG medium for the indicated time and then the levels of NO and p-eNOS were detected respectively. Mean±SEM.n=3.#P<0.05,##P<0.01vsCtrl.

圖1 HG誘導不同時間后的NO和p-eNOS水平改變

2 Nar減輕內皮損傷作用的濃度效應和時間效應關系

如圖2所示，HG組NO水平顯著下降(P<0.01)；隨著Nar濃度增加，NO水平逐漸升高，在Nar濃度為50 mg/L時達到峰值，且與HG組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；Nar濃度為100 mg/L時的NO釋放量與50 mg/L時比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，所以選擇50 mg/L為 Nar的最佳效應濃度。在時間效應中，隨著Nar處理時間延長，NO水平也逐漸升高，在 24 h時達到峰值且與HG組相比有顯著差異(P<0.01)，隨后(36 h和48 h)又稍下降但與24 h比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，故選擇24 h為Nar的最佳作用時間。

Figure 2.Effects of Nar on the NO level in HG-induced HUVECs. The HUVECs were treated with Nar at concentrations of 5, 10, 25, 50 and 100 mg/L, respectively for 24 h and the levels of NO in the supernatant were detected. Nar at concentration of 50 mg/L was used to treat the cells for different time (6, 12, 24, 36 and 48 h), and the levels of NO were detected. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsCtrl;#P<0.05,##P<0.01vsHG.

圖2 Nar 保護血管內皮細胞作用的濃度效應和時間效應關系

3 Nar、LY294002和AKT inhibitor Ⅳ對NO水平的影響

與Ctrl組比較，HG組的NO水平顯著下降(P<0.01)；HG+Nar(50 mg/L)組的NO水平較HG組顯著升高(P<0.01)；分別加入10 μmol/L LY294002和0.5 μmol/L AKT inhibitor Ⅳ后，NO水平較Ctrl組和Nar組下降(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The HUVECs were treated with Nar (50 mg/L), LY294002 (10 μmol/L) and AKT inhibitor Ⅳ (0.5 μmol/L), and the levels of NO in the supernatant were detected. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsCtrl;##P<0.01vsHG;&&P<0.01vsHG+Nar.

圖3 Nar、LY294002和AKT inhibitor Ⅳ對NO水平的影響

4 Nar、LY294002和AKT inhibitor Ⅳ對eNOS、p-eNOS、PI3K、AKT及p-AKT蛋白水平的影響

與Ctrl組相比，各組AKT和eNOS蛋白表達的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明Nar、LY294002和AKT inhibitor Ⅳ對上述蛋白表達無影響； 但各組的PI3K和磷酸化信號蛋白p-AKT和p-eNOS的水平顯著改變，如HG組上述各磷酸化信號蛋白和PI3K的水平顯著下降(P<0.01)；HG+Nar (50 mg/L)組的各磷酸化信號蛋白和PI3K的水平顯著升高(P<0.01)；加入AKT inhibitor Ⅳ抑制劑和LY294002后，Nar增加上述各磷酸化信號蛋白和PI3K蛋白水平的作用被取消，表明Nar能恢復被高糖抑制的各信號蛋白活性，并且該作用是PI3K/AKT/eNOS依賴性的，見圖4。

討 論

研究表明在血管內皮細胞可分泌多種血管活性物質，如ET、NO等，參與IRS-1/PI3K/AKT/NO和IRS-1/RAS/MAPK/ET-1等信號通路，從而調節(jié)內皮的功能[8]。但在病理狀態(tài)下(如高血糖、高胰島素血癥和高脂血癥等)，通路間的平衡可能被打破，導致內皮功能失常，從而誘發(fā)高血壓、動脈粥樣硬化和冠心病等心血管事件[9-10]。NO主要在由內皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化作用下由內皮細胞產生，當體內的NO下降時，會改變內皮細胞的通透性，促使血管內皮功能紊亂[11]。實驗中，我們使用含糖量為33 mmol/L的高糖培養(yǎng)基誘導HUVECs建立內皮損傷模型，研究柚皮苷對抗內皮損傷從而保護內皮細胞的作用機制。實驗結果表明在使用高糖誘導HUVECs 48 h后，細胞上清中NO水平和p-eNOS的水平下降且差異具有統(tǒng)計學意義，說明我們成功建立內皮細胞損傷模型。

2型糖尿病內皮功能紊亂與PI3K/AKT/eNOS信號通路受到抑制有關，且臨床常用的治療藥物羅格列酮增強eNOS的活性與上調PI3K/AKT通路有關[12]。研究表明柚皮苷具有抗炎，改善內皮損傷，胰

Figure 4.The HUVECs were treated with Nar (50 mg/L), LY294002 (10 μmol/L) and AKT inhibitor Ⅳ (0.5 μmol/L) respectively, and the protein levels of PI3K, p-AKT and p-eNOS in the HUVECs were detected by Western blotting. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsCtrl;##P<0.01vsHG.

圖4 Nar、LY294002和AKT inhibitor Ⅳ對各組細胞PI3K、p-AKT和p-eNOS蛋白水平的影響

島素抵抗以及心肌保護[3]等作用，那么柚皮苷對血管內皮的保護作用是否和PI3K/AKT/eNOS信號通路有關呢?本實驗結果表明，在損傷的細胞中加入柚皮苷后，通過檢測培養(yǎng)基上清中的NO和p-eNOS的水平發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可改善HUVECs的損傷程度；但是在分別加入PI3K和AKT抑制劑后，發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)基上清中NO水平下降，PI3K、p-AKT、p-eNOS的水平也均降低，柚皮苷改善內皮功能的作用消失。

綜上所述，本研究認為柚皮苷可以減輕HG誘導的內皮細胞損傷，且其保護作用是通過PI3K/AKT/eNOS信號通路介導的。目前研究表明臨床上所用藥物羅格列酮是通過依賴過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)的途徑來改善內皮胰島素抵抗程度，那么柚皮苷保護血管內皮細胞的作用與PPARγ是否有關，這是我們下一步的研究重點。隨著柚皮苷對內皮細胞保護作用機制研究的深入，有望能為合成和開發(fā)新的治療心腦血管疾病的藥物提供實驗基礎。

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Naringin protects human umbilical vein endothelial cells against injury induced by high glucose through PI3K/AKT/eNOS pathway

CHU Jia-jia1, 2, LI Ji-dong1, 2, LEI Lin3, KONG Ying1, 2, LI Teng1, 2, YAN Guo-qiang1, 2, SHEN Xiao-dan1, 2, WEN Jian-bing1, 2, HUANG Qi-ren1, 2

(1JiangxiProvincialKeyLaboratoryofBasicPharmacology,2DepartmentofPharmacology,CollegeofPharmacy,NanchangUniversity,Nanchang330006,China;3InstituteofCriminalScienceinYichunPoliceBureau,Yichun336000,China.E-mail:qrhuang@ncu.edu.cn)

AIM: To investigate the protective effect of naringin (Nar) on the injury of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by 33 mmol/L high glucose (HG) and to explore its possible mechanisms. METHODS: The injury model was established by treating HUVECs with HG medium for the indicated time (6, 12, 24, 48 and 72 h), and then the levels of NO, eNOS and p-eNOS were detected, respectively. The effects of Nar on high glucose-induced endothelial cell injury were observed. HUVECs were treated with Nar at concentrations of 5, 10, 25, 50 and 100 mg/L for 6 h, 12 h, 24 h, 36 h and 48 h. The levels of NO in the supernatants were measured. The effects of Nar on HG-injured HUVECs were explored by treating the cells with 10 μmol/L of LY294002, a PI3K inhibitor, or 0.5 μmol/L of AKT inhibitor Ⅳ, an AKT inhibitor, and then the levels of NO, PI3K, AKT, eNOS and their phosphorylated proteins were determined by Western blot. RESULTS: Nar at concentration of 50 mg/L significantly attenuated the injury of endothelial cells induced by high glucose (P<0.01), and the protective effects of Nar were abolished by pretreating with the inhibitor of PI3K or AKT (P<0.01). CONCLUSION: Nar protects endothelial cells against the injury induced by high glucose through PI3K/AKT/eNOS pathway.

Human umbilical vein endothelial cells; High glucose; Naringin; Endothelial nitric oxide synthase

1000- 4718(2015)04- 0625- 05

2014- 11- 21

2015- 03- 02

國家自然科學基金資助項目(No. 81360060； No. 81070633); 江西省主要學科學術和技術帶頭人培養(yǎng)計劃項目(No. 20123BCB22005)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.009

△通訊作者 Tel: 0791-86361839； E-mail: qrhuang@ncu.edu.cn

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