微小RNA-16對K562細胞向巨核細胞系分化的影響

史金龍， 劉 峰， 胡 穎， 袁玉林， 盧 運△

(1武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，湖北 武漢 430071； 2荊州市第三人民醫(yī)院普胸外科，湖北 荊州 434000)

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微小RNA-16對K562細胞向巨核細胞系分化的影響

史金龍1, 2， 劉 峰2， 胡 穎2， 袁玉林1， 盧 運2△

(1武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，湖北 武漢 430071；2荊州市第三人民醫(yī)院普胸外科，湖北 荊州 434000)

目的： 觀察微小RNA-16(microRNA-16，miR-16)對人白血病細胞K562向巨核細胞系分化的影響，并初步探索其中可能的機制。方法: 在K562細胞中通過轉(zhuǎn)染miR-16模擬物(mimics)或miR-16抑制物(inhibitor)，實時熒光定量PCR檢測miR-16的水平變化，通過流式細胞術(shù)檢測巨核細胞系分化指標(biāo)CD41、CD42b及CD61的表達。用Western blotting檢測miR-16對下游白血病癌基因(myeloblastosis oncogene,MYB)蛋白水平的影響，進而利用流式細胞術(shù)檢測miR-16是否通過影響MYB調(diào)控CD41、CD42b及CD61的表達。結(jié)果: 轉(zhuǎn)染miR-16-mimics可顯著升高K562細胞中的miR-16水平并促進CD41、CD42b及CD61的表達(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-16-inhibitor可明顯抑制K562細胞中的miR-16水平同時降低CD41、CD42b及CD61的表達(P<0.05)；Western blotting證實miR-16可調(diào)控MYB蛋白水平，而沉默MYB可逆轉(zhuǎn)miR-16對CD41、CD42b及CD61表達的調(diào)控作用。結(jié)論: miR-16可通過調(diào)控MYB的表達，調(diào)節(jié)人白血病細胞K562向巨核細胞系分化的能力。

微小RNA-16； 白血病癌基因； 巨核細胞系分化； 血小板

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)作為一類非編碼單鏈小RNAs，廣泛存在于人體各組織臟器中，可通過影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性及翻譯活性 ，參與靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在人類腫瘤、分化發(fā)育等多種疾病中均扮演重要作用[1-3]。有文獻表明微小RNA-16 (microRNA-16，miR-16)隨著巨核細胞分化成熟的過程逐漸升高，在血小板中表達明顯增加，而且miR-16可調(diào)控白血病癌基因(myeloblastosis oncogene，MYB)表達，參與B細胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]。但miR-16在巨核細胞分化中的作用尚不十分清楚，miR-16表達水平的升高是巨核細胞分化中的伴隨現(xiàn)象還是發(fā)揮重要調(diào)控作用，miR-16是否通過調(diào)控成髓細胞MYB表達參與巨核細胞分化這些問題尚待解答。本文利用miR-16模擬物(mimics)及抑制物(inhibitor)作為工具，以人白血病細胞K562作為實驗?zāi)Ｐ停荚谘芯縨iR-16對巨核細胞分化的影響，并初步探索其中可能的機制。

材 料 和 方 法

1 材料

人白血病細胞K562購自中科院上海細胞庫。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。

胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自南京凱基生物有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑及熒光定量PCR試劑購自Invitrogen；miR-16模擬物(mimics)、抑制物(inhibitor)及miR-16熒光定量PCR檢測引物均由廣州銳博生物科技公司設(shè)計并合成；抗MYB抗體、抗GAPDH抗體購自CST，抗CD41、CD42b和CD61流式抗體購自BD；MYB表達質(zhì)粒和特異性siRNA及12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA)購自Sigma。

2 實驗方法

2.1 轉(zhuǎn)染及藥物處理 miR-16模擬物(mimics)、抑制物(inhibitor)及MYB表達質(zhì)粒和特異性siRNA按照Lipofectamine 2000試劑說明書常規(guī)轉(zhuǎn)染48 h后行相關(guān)檢測，其中miR-16-mimics和inhibitor包括50 nmol/L和100 nmol/L兩種濃度，以對照microRNA(control)、空質(zhì)粒(vector)及無意亂序siRNA(si-scramble)作為實驗的陰性對照。TPA以1 nmol/L的終濃度處理K562細胞作為誘導(dǎo)其向巨核細胞系分化的陽性對照。

2.2 實時熒光定量PCR(real-time PCR) 收集各組轉(zhuǎn)染后的K562細胞，Trizol一步法提取其中總RNA，按照銳博生物說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用real-time PCR試劑盒行PCR擴增，ABI 7300檢測并分析細胞中miR-16的水平。

2.3 流式細胞術(shù)檢測CD41、CD42b 及 CD61的表達 將K562細胞以每孔1×106密度接種于6孔板，按照上述方法轉(zhuǎn)染不同濃度的microRNA、質(zhì)粒或siRNA，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，低速離心收集細胞，PBS洗滌2次后室溫孵育FITC-CD41抗體30 min，再次用PBS洗滌后流式細胞儀檢測并分析CD41、CD42b 及 CD61陽性比率。相同實驗重復(fù)3次。

2.4 Western blotting實驗 收集轉(zhuǎn)染處理后的K562細胞，加入適量RIPA裂解液，獲取細胞總蛋白液，加入SDS上樣緩沖液100 ℃水浴解除蛋白交聯(lián)。各組蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF 膜轉(zhuǎn)膜并用脫脂奶粉封閉1 h，然后依次孵育 I 抗4 ℃過夜及辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗室溫1 h后化學(xué)發(fā)光法顯影，檢測細胞中MYB表達情況，以GAPDH作為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 在K562細胞中過表達或低表達miR-16

K562細胞中轉(zhuǎn)染miR-16-mimics可顯著升高K562細胞中的miR-16水平(P<0.05)，隨著mimics濃度的增高，miR-16水平升高的更加明顯；而轉(zhuǎn)染miR-16-inhibitor可明顯抑制K562細胞中的miR-16水平(P<0.05)，隨著inhibitor濃度的增高，miR-16水平的下降更加明顯，見圖1。

Figure 1.miR-16 over- and low-expression in K562 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank and miR-control.

圖1 在K562細胞中過表達或低表達miR-16

2 miR-16對K562細胞CD41表達的影響

流式細胞術(shù)檢測miR-16對K562細胞中CD41、CD42b 及 CD61陽性比率的影響，結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染miR-16-mimics(100 nmol/L)后，CD41、CD42b 及 CD61陽性率均明顯升高，與陽性對照TPA處理后的CD41陽性率相近；而TPA處理同時轉(zhuǎn)染miR-16-inhibitor(100 nmol/L)可逆轉(zhuǎn)CD41、CD42b 及 CD61表達的上升，這表明miR-16在TPA誘導(dǎo)的K562向巨核細胞系分化的過程中發(fā)揮著重要作用，見圖2。

Figure 2.The effect of miR-16 on the differentiation of K562 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-control;#P<0.05vsTPA+miR-control.

圖2 miR-16對K562細胞分化的影響

3 miR-16對K562細胞中MYB表達的影響

干預(yù)miR-16后，利用Western blot檢測MYB蛋白水平變化，結(jié)果提示，與陰性對照組(miR-control)及空白對照組(blank)相比，miR-16-mimics可明顯降低K562細胞中MYB的蛋白水平；而轉(zhuǎn)染miR-16-inhibitor沉默miR-16的表達后，MYB的蛋白水平明顯增加，同時我們發(fā)現(xiàn)，miR-16對MYB蛋白水平的影響具有濃度依賴性。以上結(jié)果提示miR-16可能通過MYB影響K562細胞分化，見圖3。

Figure 3.The effect of miR-16 on MYB expression in the K562 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank and miR-control.

圖3 miR-16對K562細胞中MYB表達的影響

4 miR-16通過MYB影響CD41、CD42b 及 CD61的表達

為了進一步驗證miR-16是否通過MYB影響K562細胞分化，我們同時干預(yù)miR-16及MYB的表達，利用流式細胞術(shù)檢測CD41、CD42b 及 CD61的陽性率，結(jié)果提示，過表達MYB可以逆轉(zhuǎn)miR-16-mimics(100 nmol/L)對CD41、CD42b 及 CD61表達的促進作用；而沉默MYB可恢復(fù)miR-16-inhibitor(100 nmol/L)所抑制的K562向巨核細胞系分化的能力，見圖4。

討 論

研究表明，miRNAs可結(jié)合于靶基因mRNA的3’UTR區(qū)域，促進該mRNA降解或抑制核糖體的翻譯功能，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及胚胎發(fā)育器官形成等多種病理生理學(xué)進程中起重要的作用[6-7]。文獻報道，miR-16作為miR-15a/16家族中的一員，在B細胞慢性淋巴細胞白血病、黑色素瘤、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中異常表達，通過調(diào)控Bcl2、cyclin D1及MCL1等凋亡、細胞周期相關(guān)基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8-10]。也有文章表明在造血干細胞分化成為巨核細胞的過程中miR-16表達逐漸升高，并且在成熟的血小板中含量較高[4]。但miR-16在巨核細胞分化過程中的作用尚不清楚。我們在人白血病細胞K562中干預(yù)miR-16的表達，通過流式細胞術(shù)檢測巨核細胞系標(biāo)志CD41、CD42b 及 CD61的表達陽性率，發(fā)現(xiàn)miR-16升高后可以明顯促進CD41、CD42b 及 CD61的表達，且具有濃度依賴性，在TPA誘導(dǎo)的分化模型中同時抑制miR-16可部分抵消TPA的作用，這提示miR-16在巨核細胞分化過程中可能發(fā)揮重要作用。

MYB是在多個物種中高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，在血細胞的增殖和分化過程中起核心調(diào)控作用[11-12]，一般認(rèn)為，MYB表達增加可促進細胞增殖同時抑制其分化潛能，相反MYB的表達下降可抑制細胞周期進程同時促進造血干細胞及祖細胞向成熟細胞分化，既往研究表明miR-16可結(jié)合在MYB的3’端非編碼區(qū)，參與其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，我們的結(jié)果也證實了miR-16可以調(diào)控MYB的蛋白表達。同時干預(yù)MYB的水平，可以逆轉(zhuǎn)miR-16對于CD41、CD42b 及CD61的影響，提示MYB在miR-16調(diào)控CD41、CD42b 及 CD61的過程中發(fā)揮重要作用。

Figure 4.The effect of miR-16 on the differentiation of K562 cells was mediated by MYB. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-control+vector;#P<0.05vsmiR-16-mimics+vector;△P<0.05vsTPA+miR-control+si-scramble;▲P<0.05vsTPA+miR-inbibitor+si-scramble.

圖4 miR-16通過MYB影響K562細胞的分化

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)，在人白血病K562細胞中過表達miR-16，可以升高CD41、CD42b 及 CD61的表達陽性率，而低表達miR-16可抑制上述過程。進而我們通過Western blotting驗證了miR-16對MYB蛋白水平的影響，通過流式細胞術(shù)證實miR-16通過MYB調(diào)控CD41、CD42b 及 CD61的表達，初步闡明了miR-16調(diào)控K562細胞向巨核細胞系分化的分子生物學(xué)機制，為巨核細胞白血病、特發(fā)性血小板減少性紫癜等骨髓巨核細胞成熟障礙性疾病的臨床治療提供了新的藥物靶點及監(jiān)測指標(biāo)。

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Effect of miR-16 on megakaryocytic differentiation of K562 cells

SHI Jin-long1, 2, LIU Feng2, HU Ying2, YUAN Yu-lin1, LU Yun2

(1DepartmentofAnatomy,SchoolofBasicMedicine,WuhanUniversity,Wuhan430071,China;2DepartmentofGeneralandThoracicSurgery,JingzhouThirdPeople'sHospital,Jingzhou434000,China.E-mail: 2297308442@qq.com)

AIM: To observe the effect of microRNA-16 (miR-16) on the megakaryocytic differentiation of K562 cells, and to explore the potential mechanism. METHODS: miR-16 was over-expressed or silenced by transfection with miR-16 mimics or inhibitor in K562 cells. The level of miR-16 was detected by real-time PCR. The expression of CD41, CD42b and CD61, as megakaryocytic differentiation markers, was detected by flow cytometry. The effect of miR-16 on the expression of myeloblastosis oncogene (MYB) was measured by Western blotting, and flow cytometry was performed to confirm whether the effect of miR-16 on expression of CD41, CD42b and CD61 was mediated by MYB. RESULTS: Transfection with miR-16 mimics dramatically elevated the level of miR-16 and the expression of CD41, CD42b and CD61 in the K562 cells. Transfection with miR-16 inhibitor decreased the level of miR-16 and the expression of CD41, CD42b and CD61 in the K562 cells (P<0.05). The expression of MYB was regulated by miR-16, andMYBsilencing reversed the regulation of CD41, CD42b and CD61 induced by miR-16. CONCLUSION: miR-16 regulates the megakaryocytic differentiation of K562 cells by targetingMYB.

MicroRNA-16; Myeloblastosis oncogene; Megakaryocytic differentiation; Platelets

1000- 4718(2015)04- 0585- 05

2014- 12- 17

2015- 03- 04

R558; R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.002

△通訊作者 Tel: 0716-8316451; E-mail: 2297308442@qq.com