葉酸及維生素B12檢測方法的發(fā)展及現(xiàn)狀

陳偉才　李忠信　渠　?！「豆庥睢?/p>

葉酸及維生素B12檢測方法的發(fā)展及現(xiàn)狀

陳偉才1李忠信2渠海2付光宇2★

［摘要］本文簡要概括了人體內(nèi)葉酸及維生素B12檢測方法的發(fā)展歷史及現(xiàn)狀，結(jié)合前人研究對現(xiàn)階段應(yīng)用最為廣泛的化學(xué)發(fā)光檢測方法著重分析，討論了葉酸及B12檢測試劑盒開發(fā)過程中常見的困難點，葉酸和B12檢測標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)狀，為臨床應(yīng)用工作的展開提出建議。

［關(guān)鍵詞］葉酸；維生素B12；化學(xué)發(fā)光法；檢測分析；臨床

作者單位：1．廣東省佛山市順德區(qū)中醫(yī)院檢驗科，廣東，佛山528333 2．鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南，鄭州450016

The development of detection methods for folic acid and vitamin B12

CHEN Weicai1, LI Zhongxin2, QU Hai2, FU Guangyu2★
(1. Department of Clinical Laboratory, Chinese Medicine Hospital of Shunde District in Foshan City, Foshan, Guangdong, China, 528333; 2. Zhengzhou Autobio Biological Engineering Co.，Ltd．, Zhengzhou, Henan, China, 450016)

[ABSTRACT] In the beginning we made a brief summary of the development history and present situation about the detection of human folic acid and vitamin B12. A further discussion on the chemiluminescence method based on previous studies is conducted, which is most widely used at the present stage. And then we stated the key points during the R&D of Folate & B12detection agents, especially the difficulty in the establishment of standards. Finally we raised some advice to clinical workers.

[KEY WORDS] Folic acid; Vitamin B12; Chemiluminescence; Assay; Clinical

葉酸（folic acid）是與蝶酰谷氨酸（pteroylglutamic acid，PGA）功能和化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的一類化合物的統(tǒng)稱，又稱為維生素B9。葉酸是人體必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，對人體具有重要的生理功能，是人體許多生化反應(yīng)的輔酶。在人體內(nèi)葉酸攜帶一碳單位形成5-甲基四氫葉酸、亞甲基四氫葉酸等活性形式發(fā)揮作用，其中5-甲基四氫葉酸是人體內(nèi)活性葉酸的主要存在形式。研究證實，葉酸除了與巨幼紅細(xì)胞性貧血有關(guān)外，還與新生兒神經(jīng)管畸形，結(jié)腸癌、白血病等癌癥，心腦血管疾病以及兒童智力低下有關(guān)，也可以導(dǎo)致出生缺陷發(fā)生率上升，例如先天性心臟病、唇腭裂以及唐氏綜合癥等［1］。此外，葉酸缺乏還可以引起早產(chǎn)、流產(chǎn)等不良妊娠的發(fā)生［2］。

維生素B12又稱氰鈷胺素、鈷胺素、外源因子、動物蛋白因子，是唯一含有礦物質(zhì)的維生素。維生素B12貧乏也是巨幼紅細(xì)胞性貧血癥的誘因，同時也與老年癡呆癥、抑郁癥以及冠心病等有關(guān)。

葉酸和B12都是人體內(nèi)一碳單位轉(zhuǎn)移的重要輔助因子，故在諸多生化反應(yīng)中都起到協(xié)同作用，例如都是DNA合成過程中重要的輔酶，參與DNA合成，降低血漿中同型半胱氨酸水平［3］等。無論是臨床檢測應(yīng)用還是學(xué)術(shù)研究，通常都將二者放在一起，檢測方法也極為類似。

葉酸和維生素B12重要臨床意義的發(fā)現(xiàn)引發(fā)了學(xué)術(shù)界對其的廣泛關(guān)注，準(zhǔn)確而高效的葉酸及B12檢測手段也就顯得極為重要。但由于葉酸和B12在人體內(nèi)含量極低，體外穩(wěn)定性極差，具有生物活性的相關(guān)化合物組成復(fù)雜等原因，對其分析相當(dāng)困難［4］，直至今日，對于葉酸和B12的檢測標(biāo)準(zhǔn)依然未能夠達(dá)成共識。

1　葉酸及維生素B12檢測方法的發(fā)展及現(xiàn)狀

經(jīng)過半個多世紀(jì)的研究，學(xué)者們根據(jù)檢測對象的不同開發(fā)出了多種檢測樣品中葉酸或B12的方法，如比色法、薄層層析法、氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜法、微生物法和同位素放射免疫法等。一般測定原料葉酸或B12、純?nèi)~酸或B12制品或藥品制劑中的葉酸或B12質(zhì)量分?jǐn)?shù)常采用比色法；而生物體、食品中葉酸的測定多采用微生物法、同位素放射免疫法或色譜法、色-質(zhì)聯(lián)用法以及最新的離子捕獲法，化學(xué)發(fā)光法和生物傳感法。其中微生物分析法，以其經(jīng)典、準(zhǔn)確可靠性為許多國際標(biāo)準(zhǔn)方法機構(gòu)作為標(biāo)準(zhǔn)方法或第一法［5］，而化學(xué)發(fā)光法為目前應(yīng)用最廣泛的檢測方法。

1．1葉酸及維生素B12檢測方法的發(fā)展

微生物法和同位素放射免疫法是葉酸和B12檢測的經(jīng)典方法，上世紀(jì)歐美針對人群體內(nèi)葉酸及B12水平的普查以及大量臨床研究，均采用這兩種方法。但兩種方法在準(zhǔn)確性上一直有爭議。

微生物法的優(yōu)點是成本低，可操作性強，能夠檢測到極低濃度的葉酸或B12水平，缺點是由于微生物法不能夠區(qū)分葉酸或B12的各種形式，所測結(jié)果一般為總的葉酸或B12量，準(zhǔn)確度較低，重復(fù)性較差，無法形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)［6］；同位素放射免疫法利用同位素標(biāo)記的葉酸或B12受體進(jìn)行檢測，相比微生物法較為便攜與迅速，但是放免法采用的葉酸受體對樣本中不同形式的葉酸或B12親和力大不相同，靈敏度較差［7］，并且放免法存在放射線輻射和污染等問題，同時受樣本基質(zhì)、緩沖體系以及pH影響較大，不同試劑盒檢測結(jié)果偏差較大。

1995年Wilson等［8］提出離子捕獲法檢測葉酸，樣品加入變性劑后葉酸與內(nèi)源性結(jié)合蛋白分離，釋放后的葉酸再與帶有大量陰離子的親合試劑結(jié)合，合成產(chǎn)物經(jīng)過離子捕獲池而與陽離子纖維結(jié)合，最后通過堿性磷酸酶與蝶酸（葉酸的類似物）結(jié)合物對葉酸結(jié)合蛋白上游離結(jié)合位點的探查，定量分析樣品中葉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。該研究證實，當(dāng)離子捕獲法測定血清或紅細(xì)胞中的葉酸時，其結(jié)果與同位素放射免疫法的結(jié)果具有良好的相關(guān)性。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLCMS）于1999年最早報道應(yīng)用于葉酸分析［9］，該技術(shù)不僅能夠快速、高效地分離葉酸化合物，而且質(zhì)譜儀的高靈敏度滿足了低檢測限的要求，具有樣品用量少、自動化程度高等優(yōu)點、無論對定性及定量分析都顯示了巨大的優(yōu)勢。目前，利用HPLCMS聯(lián)用方法檢測葉酸化合物主要集中于對食品和臨床樣品，并且都已顯示出較好的應(yīng)用前景，已逐步成為較為權(quán)威的葉酸檢測手段。

90年代，有學(xué)者相繼提出用非放射性標(biāo)記蛋白結(jié)合技術(shù)檢測血液葉酸，其中包括克隆酶供體免疫測定法（cloned enzyme-donor immunoassay，CEDIA）、ELISA、化學(xué)發(fā)光受體實驗等?；瘜W(xué)發(fā)光檢測法易于實現(xiàn)自動化，檢測重現(xiàn)性好，靈敏度較高，對低濃度葉酸樣品檢測結(jié)果明顯高于其他方法［10］，是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的檢測方法，本文將對此方法著重介紹。

1．2葉酸及維生素B12的化學(xué)發(fā)光檢測法

1．2．1葉酸

化學(xué)發(fā)光法檢測葉酸目前均采用競爭法的原理，一般使用從牛奶中提取的葉酸結(jié)合蛋白（folate-binding proteins，F(xiàn)BP）作為免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)。研究證實，此類FBP對血清中葉酸主要的活性結(jié)構(gòu)均有很高親和力［11］；樣本中與內(nèi)源性葉酸結(jié)合蛋白結(jié)合的葉酸以及蝶酰多聚谷氨酸則需要經(jīng)過解離（酸解離，堿解離或酶解離）。

1．2．2維生素B12

化學(xué)發(fā)光法檢測維生素B12也采用競爭法的原理，一般都使用內(nèi)因子（IF，人體吸收轉(zhuǎn)運B12的重要載體蛋白）作為免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)。血清中的維生素B12也需要經(jīng)解離轉(zhuǎn)變成為游離形式后才能與IF進(jìn)行結(jié)合。另外，由于天然維生素B12在體外并不穩(wěn)定，通常還需要在預(yù)處理環(huán)節(jié)中添加氰化鉀使之轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的形態(tài)［12］。

一直以來，葉酸及維生素B12用以臨床推廣使用的檢測試劑盒的開發(fā)十分困難。首先，葉酸和B12的理化性質(zhì)十分不穩(wěn)定，暴露在空氣中很容易受到光、氧氣和金屬離子的影響而失去活性。例如Jansen EH，Beekhof PK［13］對葉酸和B12研究發(fā)現(xiàn)部分葉酸活性結(jié)構(gòu)在－20℃儲存4天含量降低了60%，而B12則至少在－70℃條件才能長期儲存。其次，葉酸和B12在人體內(nèi)具有生物活性的相關(guān)化合物組成復(fù)雜，而且含量極低，對試劑盒靈敏度和精密度有很高要求；關(guān)于葉酸和FBP親和力的研究也持續(xù)了很長一段時期。再有，葉酸和B12本身分子質(zhì)量太小，用于包被用的葉酸或B12的衍生物和IF抗體制備工藝復(fù)雜。

經(jīng)過各界學(xué)者不斷的研究，對葉酸和B12檢測試劑盒的開發(fā)逐漸達(dá)成了一些共識：鑒于葉酸和B12的不穩(wěn)定性，樣本在采集、轉(zhuǎn)移和儲存過程中需要特別注意環(huán)境溫度以及光照環(huán)境，并依據(jù)樣本保存條件在規(guī)定時間內(nèi)檢測樣本以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及臨床意義的有效性；抗氧化劑也是一種必須的方法，在各組分的緩沖液中添加抗氧劑，如檸檬酸、抗壞血酸、2－巰基乙醇等，用以保護(hù)不穩(wěn)定的葉酸［14］，并使用不透光容器保存相關(guān)組分，最大程度上保護(hù)葉酸或B12及其衍生物的穩(wěn)定性，提高檢測結(jié)果的穩(wěn)定性以及精密性；對待檢樣本進(jìn)行解離處理，有研究發(fā)現(xiàn)，在酸性（pH＝3．5）環(huán)境中，約90%以上的葉酸谷氨酸多聚體能夠轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w形式［15］，另外，堿解離和酶解離也用于許多葉酸、B12分析研究中；由于免疫反應(yīng)比較嚴(yán)苛，必須保證適宜的pH、電解質(zhì)環(huán)境和排除交叉反應(yīng)，葉酸維持穩(wěn)定最適宜的pH與和FBP結(jié)合的最適pH存在差異，抗氧劑（如2－巰基乙醇）、解離劑（酸堿或解離酶）都會干擾免疫反應(yīng)和檢測，檢測試劑盒開發(fā)過程中都必須進(jìn)行必要的處理和調(diào)整；另外，不同平臺的化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)有不同的發(fā)光偵測體系，在辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）催化發(fā)光的體系中，還應(yīng)特別注意排除全血葉酸檢測中血紅蛋白（HRP結(jié)構(gòu)類似物）的干擾，有學(xué)者進(jìn)行專項研究，發(fā)現(xiàn)合適的陰離子型或非離子型表面活性劑對血紅蛋白的有很好的清潔效果［16］。

1．2．3葉酸和維生素B12的化學(xué)發(fā)光檢測法檢測標(biāo)準(zhǔn)

雖然在檢測原理上，各大廠商基本上達(dá)共識，然而，許多學(xué)者或機構(gòu)對不同廠商試劑盒的檢測結(jié)果進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用最廣的幾種檢測試劑盒在檢測結(jié)果上仍存在顯著差異［15］。在體外診斷行業(yè)飛速發(fā)展的今天，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的建立意義重大，國際相關(guān)知名的標(biāo)準(zhǔn)實驗室及組織機構(gòu)也一直在致力于此方面的研究，如ASCP等。無論是以改良后的微生物測定法還是高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法做參比，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各大廠商試劑盒的檢測結(jié)果存在明顯差異，這體現(xiàn)在檢測結(jié)果與參比方法的比對以及回收實驗的結(jié)果中［17－18］。

上述學(xué)者或機構(gòu)對這種檢測結(jié)果的差異進(jìn)行了調(diào)查和統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)造成這種差異的原因主要集中在以下幾個方面：首先，溯源不同，各大廠家在試劑盒開發(fā)過程中均采用了不同的溯源途徑，有的以WHO標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溯源，有的以改良后的微生物測定法作為溯源，有的以上世紀(jì)臨床與研究應(yīng)用最為廣泛的Bio-Rad公司的同位素放射免疫試劑盒作為溯源，溯源本身就一直存在爭議與差異；其次用于校正檢驗結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不同，有的以單體葉酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，有的以總?cè)~酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，校準(zhǔn)曲線的擬合方式也存在差別［19］；校準(zhǔn)品的緩沖基質(zhì)不同，大量研究已經(jīng)證實，在以FBP作為葉酸檢測手段時，校準(zhǔn)物質(zhì)利用血清基質(zhì)作為緩沖體系時比利用無機鹽添加蛋白輔料的緩沖體系所得到的檢測結(jié)果偏高［7］；另外，對FBP和葉酸以及IF和B12之間結(jié)合模型或方式的研究還不夠透徹，樣本預(yù)處理工藝［17］也是各廠家的核心工藝及機密，無法得到有效交流，這都對葉酸和B12檢測標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一造成了很大的困難；葉酸和B12的臨床指標(biāo)不明確，醫(yī)學(xué)界并未為葉酸和B12規(guī)定確切的參照水平，單從目前臨床應(yīng)用講，各廠家試劑盒均能基本滿足臨床要求。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法為葉酸和B12檢測標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了可行方案，但筆者認(rèn)為，對葉酸、B12與相應(yīng)結(jié)合蛋白的結(jié)合機制，各活性組分相互的轉(zhuǎn)化的研究以及醫(yī)學(xué)界對葉酸、B12檢測的引導(dǎo)才是最終統(tǒng)一葉酸、B12檢測標(biāo)準(zhǔn)的根本。

2　葉酸和維生素B12檢測的臨床應(yīng)用

2007年，國家啟動了“出生缺陷干預(yù)工程”，全國各大醫(yī)院也陸續(xù)開展了葉酸和B12檢測項目。但調(diào)查發(fā)現(xiàn)，許多葉酸和B12的檢測項目在開展過程中存在許多的不足與誤區(qū)。

首先，需要明確全血葉酸和血清葉酸檢測指標(biāo)。眾所周知，全血中的葉酸水平能夠反映個體近期真實的葉酸及營養(yǎng)水平，而血清葉酸只能夠體現(xiàn)極短時間內(nèi)個體的葉酸水平，且極易受飲食的影響。全血葉酸的檢測指標(biāo)應(yīng)受到更多的重視。其次，由于全血葉酸檢測步驟遠(yuǎn)比血清葉酸檢測復(fù)雜，成本也高出許多，與現(xiàn)階段臨床快速便捷的診斷需要相違背，在全血葉酸檢測工藝尚未能夠完全滿足臨床需求的事實下，血清葉酸檢測項目的規(guī)范化尤為重要。

全球有16．2億人貧血，而孕前或妊娠中的婦女中這一比例達(dá)到42%［20］。鐵和葉酸的補充孕前或妊娠中的婦女應(yīng)特別重視。研究證實，正常人在服用葉酸片后在2 h～4 h內(nèi)達(dá)到峰值，約8小時后趨于穩(wěn)定，正在參與葉酸補服的孕前或妊娠中的婦女進(jìn)行葉酸檢測時，如果直接進(jìn)行血清葉酸檢測，增補的葉酸停留在血清中尚未被紅細(xì)胞吸收，檢測結(jié)果不能夠最真實的反應(yīng)個體葉酸水平。建議在檢測個體血清葉酸時前讓個體提前2 d～3 d停止補服葉酸，并進(jìn)行空腹采血。

葉酸和B12的不穩(wěn)定性對樣本的采集和保存提出了較高要求。各廠商試劑盒以及前人學(xué)者的研究，一般建議在2 h之內(nèi)完成對新采集樣本的檢測，不能及時檢測的應(yīng)置于2℃～8℃環(huán)境保存并在8 h內(nèi)完成檢測，－20℃凍存樣本應(yīng)在1w內(nèi)完成檢測，樣本在轉(zhuǎn)移和儲存過程中應(yīng)注意冷藏、封閉和避光。

臨床應(yīng)用與研究對葉酸、B12檢測手段的進(jìn)步的重要性不言而喻，對葉酸、B12試劑盒的開發(fā)，檢測標(biāo)準(zhǔn)的建立有十分重要的意義。在廠商與臨床的配合中，臨床應(yīng)用過程中的規(guī)范性需要得到廣大臨床工作者的廣泛注意。

綜上所述，關(guān)于葉酸和維生素B12的檢測，準(zhǔn)確快捷低成本的全自動化學(xué)發(fā)光檢測法仍將是主流。如此，檢測標(biāo)準(zhǔn)的建立迫在眉睫，這需要科研機構(gòu)的學(xué)者專家、臨床工作者和各廠商試劑研發(fā)實驗室的共同努力。一方面需要明確FBP、IF的作用機制，促進(jìn)葉酸和B12結(jié)構(gòu)形式轉(zhuǎn)變及預(yù)處理工藝方面的學(xué)術(shù)交流并達(dá)成共識；另一方面需要臨床工作者通過良好的認(rèn)識和操作為研究反饋真實有效的指導(dǎo)；還需要試劑開發(fā)廠商明確工作重點，不盲目迎合并真正致力于臨床研究。

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通訊作者：★付光宇，E-mail：fuguangyu＠autobio．com．cn

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（2011AA02A101）