胃癌的液相活檢

摘要：本文通過(guò)系統(tǒng)回顧外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)細(xì)胞外核酸在胃癌早期診斷、預(yù)后評(píng)估、治療監(jiān)測(cè)中的作用，闡述其作為新型生物標(biāo)記物的可能性，介紹胃癌液相活檢的概念由來(lái)和其潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

收稿日期：2015-05-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2012AA021103）

作者簡(jiǎn)介：王達(dá)，八年制博士，E-mail: wangda.0618@aliyun.com

通信作者：李國(guó)新，博士，主任，教授，博士生導(dǎo)師，電話：020-61641682，E-mail: gzliguoxin@163.com

Liquid biopsy of gastric cancer

WANG Da, LI Tingting, LEI Shangtong, LIU Hao, LI Guoxin

Department of General Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

Abstract: The literature concerning the role of circulating tumor cells and cell- free nucleic acids in gastric cancer were systematically reviewed with respect to early diagnosis, prognosis evaluation and therapy monitoring. Both of them considered as candicates were explored to be potential biomarkers. Herein, we introduced the origin of the novel concept, liquid biopsy of gastric cancer, and possibility of their clinical application in therapeutic management of cancer patients.

Key words: gastric cancer; liquid biopsy; circulating tumor cells; cell-free nucleic acids

胃癌是世界上是第4大最常見(jiàn)的癌癥，占癌癥相關(guān)死亡第2位 ［1］。盡管近些年來(lái)診斷技術(shù)和圍手術(shù)期管理等方面得到很大改進(jìn)，但胃癌的控制形勢(shì)依然不容樂(lè)觀，在胃癌死亡率沒(méi)有明顯下降的情況下，每年全球新發(fā)胃癌病例近90萬(wàn)例 ［1］。這主要與以下幾個(gè)方面因素相關(guān)，一是缺乏行之有效進(jìn)行早期診斷的方法；二是缺乏科學(xué)系統(tǒng)的預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)；三是進(jìn)展期胃癌手術(shù)或化療治療充分性存在不足；四是胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及其產(chǎn)生耐藥的原理尚不清楚。因此，為了改善胃癌患者的臨床結(jié)局，早期發(fā)現(xiàn)和準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)疾病發(fā)生進(jìn)展是十分必要的。

許多遺傳和表觀遺傳學(xué)的改變促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)這些變化能夠用于診斷胃癌在內(nèi)的惡性腫瘤，并能評(píng)估其預(yù)后，或者作為制定治療方案的依據(jù) [2,3]。通常，對(duì)于實(shí)體腫瘤來(lái)說(shuō)，只有手術(shù)活檢標(biāo)本才可用于檢測(cè)腫瘤相關(guān)的分子水平上的改變，但傳統(tǒng)的組織活檢病理有諸多限制：（1）單處取材無(wú)法體現(xiàn)異質(zhì)性；（2）單次活檢無(wú)法實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；（3）活檢本身創(chuàng)傷大并容易致播散。所以，如能開發(fā)一種非侵入式的檢測(cè)方法在血液中獲取生物標(biāo)記物，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)生發(fā)展并能反饋藥物治療反應(yīng)意義重大，可以有效克服上述傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)?；诖讼敕?，“液相活檢”這個(gè)概念應(yīng)運(yùn)而生，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）和細(xì)胞外游離核酸（cfNA）的發(fā)現(xiàn)使之從理想變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)創(chuàng)造了條件 ［2，4］。本文就CTC、cfNA與胃癌的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1　循環(huán)腫瘤細(xì)胞與胃癌

1.1循環(huán)腫瘤細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)與檢測(cè)

自Ashworth在1869年第1次發(fā)現(xiàn)CTC以來(lái)，對(duì)CTC的關(guān)注從未間斷，研究者們?cè)诓煌瑢?shí)體腫瘤患者的血液中驗(yàn)證CTC的存在 [5]。早期，由于技術(shù)瓶頸，從外周血中精確檢測(cè)極低濃度的CTC是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。近些年來(lái)，隨著技術(shù)發(fā)展，CTC的分離富集問(wèn)題迎刃而解，目前主流方法有物理法和免疫學(xué)兩種。前者主要根據(jù)CTC大小、密度、電荷、遷移變形能力等進(jìn)行分篩 [6-7]；后者則通過(guò)CTC表面攜帶的特定結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)來(lái)進(jìn)行獲取 ［8-9］，所獲得的CTC可以通過(guò)（熒光定量）PCR、FISH、標(biāo)記抗原識(shí)別等技術(shù)手段進(jìn)行鑒定。目前這兩種方法都能在集成系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)，為后續(xù)的CTC相關(guān)研究創(chuàng)造可能 ［10-11］。

1.2循環(huán)腫瘤細(xì)胞在胃癌研究中的作用1.2.1利用循環(huán)腫瘤細(xì)胞尋找胃癌易感基因獲得CTC后，RT-PCR一度成為主要研究手段，用以發(fā)現(xiàn)易感基因及其生物學(xué)功能。至今為止，與胃癌涉及緊密的主要有人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶（hTERT),細(xì)胞角蛋白(CK)家族, CEA和黏蛋白1（MUC1）等 ［12-14］。但其固有的高假陽(yáng)性率限制了該領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展，直到引入定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）后有了起色。但Wu等人 ［14］并不滿足于此，他們發(fā)明了一種高通量比色膜陣列，能夠同時(shí)檢測(cè)四種標(biāo)記物，可較為敏感地預(yù)測(cè)胃癌患者的總生存率和術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率。最近，非編碼RNA比如microRNA（miRNA）和Piwi-interacting RNAs（piRNA）等被證實(shí)在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中表達(dá)異常，這一特異性改變有望成為胃癌CTC檢測(cè)的突破 ［15-16］。然而，這種從外周血單個(gè)核細(xì)胞獲取的總RNA卻不能排除源于白細(xì)胞的RNA的干擾而純粹真實(shí)地反應(yīng)CTC中miRNA。當(dāng)然，這也同樣困擾著外周血細(xì)胞外游離miRNA的檢測(cè)。如何減少雜質(zhì)RNA的影響，可能要從尋找更為敏感確切的特異性miRNAs和piRNA入手，只有這樣才能更符合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的需要。

1.2.2利用循環(huán)腫瘤細(xì)胞監(jiān)測(cè)胃癌　腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與不良臨床預(yù)后關(guān)系緊密，并嚴(yán)重影響胃癌患者的生活質(zhì)量。近來(lái)，不斷有研究提示CTC本身即可作為臨床預(yù)后指標(biāo)。Hiraiwa等 ［17］利用CellSearch System發(fā)現(xiàn)外周血中CTC≥2組總生存率顯著低于CTC<2組；Matsusaka等 ［18］人則發(fā)現(xiàn)CTC≥4組的化療病人總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期要顯著小于CTC<4組，這一發(fā)現(xiàn)啟示我們，CTC水平也許與化療藥物治療反應(yīng)相關(guān)。還有研究者將圍手術(shù)期的胃癌病人外周血CTC水平進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后CTC水平較術(shù)前明顯降低，有趣的是，部分研究提示術(shù)中CTC水平會(huì)有所增加，盡管這一現(xiàn)象尚有爭(zhēng)議，但至少說(shuō)明一點(diǎn)，CTC可能作為監(jiān)測(cè)腫瘤動(dòng)態(tài)變化的生物標(biāo)記物 ［19］。

CTC所攜帶的基因、蛋白亦被認(rèn)為潛在的預(yù)測(cè)指標(biāo)。不少研究提示CEA、CK系列等標(biāo)記物的mRNA水平與胃癌的總生存期、無(wú)進(jìn)展生存期等相關(guān) ［12, 20-21］。其中，值得注意的是，Mimori等 ［22］利用基因芯片技術(shù)篩選得到膜基質(zhì)金屬蛋白酶1（MT1-MMP）基因，通過(guò)qRTPCR檢測(cè)MT1-MMP mRNA水平發(fā)現(xiàn)其為胃癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這是目前臨床樣本量最大的研究之一。

目前CTC在胃癌領(lǐng)域的相關(guān)研究已有彌足進(jìn)步，是具備巨大開發(fā)前景的潛在胃癌標(biāo)記物。但是，我們對(duì)于外周血中這一類細(xì)胞的生物學(xué)特性尚知之甚少，是下一步研究攻克的方向，以便更好地理解其在胃癌進(jìn)展和耐藥發(fā)生過(guò)程中的生物學(xué)行為。

2　細(xì)胞外游離核酸與胃癌

2.1細(xì)胞外游離核酸的發(fā)現(xiàn)與檢測(cè)

細(xì)胞外游離核酸(cfNAs)包括DNA、RNA、microRNA等組成。細(xì)胞外游離核酸最早由Mandel和Metais 于1948年在血漿中發(fā)現(xiàn)，卻直到1977年由Leon等 [4]人報(bào)道在腫瘤患者血清中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外游離脫氧核酸（cfDNA）才受到重視。1989年Vasioukhin等 ［23］首次證實(shí)腫瘤組織能夠釋放DNA至外周血中，這一假設(shè)被后續(xù)的NRAS和KRAS基因研究所佐證 ［24］。隨后RNA、miRNA相繼在外周血中被發(fā)現(xiàn)。關(guān)于細(xì)胞外游離核酸的來(lái)源目前有被動(dòng)和主動(dòng)釋放兩種主要學(xué)說(shuō)，前者認(rèn)為，細(xì)胞外游離核酸主要來(lái)源于凋亡或壞死的細(xì)胞；后者可能的解釋為，腫瘤細(xì)胞通過(guò)釋放DNA入血，由遠(yuǎn)處的特定的靶細(xì)胞負(fù)責(zé)接收，這也許是腫瘤轉(zhuǎn)移可能的發(fā)生機(jī)制，目前尚缺乏足夠證據(jù)支持 ［25-27］。還有人推測(cè)細(xì)胞外游離核酸來(lái)源于CTC，但兩者數(shù)量級(jí)別并不對(duì)等，因而爭(zhēng)議頗多 ［2, 28］。因?yàn)榧?xì)胞外游離核酸在血漿或血清中存在，故檢出手段并無(wú)特殊。

2.2細(xì)胞外游離核酸在胃癌研究中的作用

2.2.1利用細(xì)胞外游離DNA監(jiān)測(cè)胃癌細(xì)胞外游離DNA在腫瘤領(lǐng)域的研究由來(lái)已久，主要涉及到腫瘤相關(guān)的基因或表觀遺傳學(xué)的改變，包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、雜合度消失、基因多態(tài)性、定點(diǎn)突變、基因甲基化、染色體缺失轉(zhuǎn)位和基因片段縮短等方面。目前研究較為成熟的經(jīng)典案例，如外周血中的細(xì)胞外游離DNA中的KRAS基因突變與結(jié)直腸癌抗EGFR單抗藥物獲得性耐藥之間的聯(lián)系緊密 ［29］，在此基礎(chǔ)上，Misale等 ［30］發(fā)現(xiàn)能在西妥昔單抗治療的腫瘤病人中檢出血液KRAS基因等位基因突變，而根據(jù)這一結(jié)果能早于影像學(xué)檢查約10個(gè)月得出耐藥結(jié)論。此發(fā)現(xiàn)提示我們外周血細(xì)胞外游離DNA是潛在的腫瘤特異性標(biāo)記物，可為腫瘤綜合治療個(gè)體化方案提供依據(jù)。

利用細(xì)胞外游離DNA檢測(cè)胃癌的研究亦有較大進(jìn)展，其中除了將細(xì)胞外游離DNA總量、外周血管家基因、非編碼基因組DNA水平改變做為檢測(cè)指標(biāo)外，值得注意的是，DNA甲基化研究領(lǐng)域突破最大。自Lee等 ［31］在2002年首次報(bào)道死亡相關(guān)蛋白激酶,鈣黏蛋白E-cadherin，谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶pi基因1（GSTP1），p15 and p16 DNA甲基化水平能夠有效預(yù)測(cè)胃癌以來(lái)，甲基化CpG島微陣列技術(shù)等新手段的出現(xiàn)為尋找更為可靠的目標(biāo)基因奠定了基礎(chǔ)。目前，XAF1基因DNA甲基化最受矚目，Ling等 ［32］證實(shí)其為胃癌預(yù)后的較好指標(biāo)，敏感度和特異度分別為69.8%和100%。而在傳統(tǒng)的腫瘤特異性基因檢測(cè)領(lǐng)域，外周血MYC被Park團(tuán)隊(duì) ［33］證實(shí)與胃癌標(biāo)本中的相同基因的變化趨勢(shì)一致，而在HER-2 ++ 或+++的胃癌病人中外周血HER-2水平與組織標(biāo)本中變化趨勢(shì)不一致 ［34］。爭(zhēng)議伴隨著進(jìn)步，這方面研究尚屬起步階段，未來(lái)將有新的證據(jù)來(lái)闡釋這些矛盾。

2.2.2利用細(xì)胞外游離RNA監(jiān)測(cè)胃癌起初，RNA因容易降解而不可避免地會(huì)丟失一些信息，故其在外周血檢測(cè)時(shí)是否能夠準(zhǔn)確反映腫瘤發(fā)展遭受質(zhì)疑。科學(xué)家們一度曾把目光轉(zhuǎn)向外周血RNA酶的檢測(cè)，但并未有很大突破。1999年，人們開始發(fā)現(xiàn)外周血中相對(duì)穩(wěn)定存在的RNA，一部分以蛋白脂質(zhì)形式存在，另一部分則以小分子RNA形式存在 ［35-36］?？茖W(xué)家們首先在鼻咽癌患者血液中發(fā)現(xiàn)一種EB病毒相關(guān)的RNA，能夠特異性地反應(yīng)腫瘤相關(guān)臨床特征 ［36］。隨后，MUC1、CXCR4等基因的mRNA相繼被報(bào)道與胃癌進(jìn)展相關(guān) ［37］。之后，Kang等 ［38］證實(shí)外周血hTERT mRNA的變化可作為胃癌診斷預(yù)后檢測(cè)的潛在標(biāo)記物。

目前，這些RNA穩(wěn)定存在的機(jī)制尚不明確，當(dāng)下廣為接受的主流假說(shuō)是囊泡分泌學(xué)說(shuō) ［39］。即便產(chǎn)生的方式尚完全不為人所知，外周血細(xì)胞外游離RNA已成為腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，而其中的miRNA更是炙手可熱的話題。

2.2.3利用細(xì)胞外游離miRNA監(jiān)測(cè)胃癌miRNA是一種由小片段核酸組成非編碼RNA，能通過(guò)抑制mRNA穩(wěn)定性和翻譯過(guò)程實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。大量研究證實(shí)miRNA在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、上皮間質(zhì)化（EMT）、腫瘤轉(zhuǎn)移等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。自2008年以來(lái)，聚焦于外周血miRNA與惡性腫瘤之間關(guān)系的研究呈現(xiàn)井噴式爆發(fā)，相關(guān)的技術(shù)手段亦隨之得到長(zhǎng)足進(jìn)步，目前已開始向高通量集成方向發(fā)展。2010年，Tsujiura等 ［40］首次報(bào)道外周血miRNA (miR-17-5p, miR-21, miR-106a, miR-106b and let-7a)可能成為胃癌新的腫瘤標(biāo)記物。此后，近30種miRNA先后被發(fā)現(xiàn)在胃癌的不同階段表達(dá)異常，均提示著其作為新生物標(biāo)記物的可能性。然而，至今為止miRNA作為檢驗(yàn)指標(biāo)尚有幾個(gè)問(wèn)題亟待解決：（1）如何消除個(gè)體差異；（2）如何篩選待檢的miRNA；（3）如何界定臨界值？這些問(wèn)題部分來(lái)源于人體內(nèi)復(fù)查的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，因?yàn)?個(gè)miRNA可調(diào)控多個(gè)mRNA，而特定mRNA又可由多個(gè)miRNA調(diào)控。為了克服這一缺陷，人們開發(fā)了miRNA基因組分析方法，并由此得到目前最有開發(fā)前景的兩個(gè)生物標(biāo)記物miR-451和miR-486，各自在受試者工作特征曲線中的曲線下面積為0.96和0.92，提示胃癌預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性較高 ［41］。盡管如此，它們的有效性還需要大規(guī)模的臨床研究來(lái)驗(yàn)證。

2.2.4利用細(xì)胞外游離lncRNA監(jiān)測(cè)胃癌長(zhǎng)鏈非編碼RNA (lncRNA)由200個(gè)以上核酸序列組成，因?yàn)椴缓_放閱讀框而無(wú)法編碼蛋白，但卻能廣泛參與RNA加工過(guò)程，進(jìn)而調(diào)控基因、影響染色體的修飾。lncRNA日益成為當(dāng)下的研究新寵，在發(fā)育學(xué)和腫瘤學(xué)方面飽受關(guān)注。最近，Arita等 ［42］首次報(bào)道利用細(xì)胞外游離lncRNA監(jiān)測(cè)胃癌，研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中l(wèi)ncRNA H19較正常人顯著升高，而在術(shù)后下降，提示H19是良好的診斷指標(biāo)。雖然我們對(duì)lncRNA還知之甚少，隨著研究深入，相信會(huì)有更為喜人的突破。

3　結(jié)論

綜上所述，得益于技術(shù)手段的突飛猛進(jìn)，使得利用外周血進(jìn)行胃癌的“液相活檢”成為可能。無(wú)論是循環(huán)腫瘤細(xì)胞還是循環(huán)細(xì)胞外游離核酸，在胃癌領(lǐng)域的研究都尚處搖籃時(shí)期，但其潛在的實(shí)用價(jià)值已初見(jiàn)端倪。未來(lái)，將有大規(guī)模的臨床研究篩選得到切實(shí)有效的生物標(biāo)記物，能夠用于胃癌的預(yù)測(cè)、診斷、評(píng)估和監(jiān)測(cè)，從實(shí)驗(yàn)室到臨床的成功轉(zhuǎn)化最終使廣大胃癌患者受益。