微生物在食品檢測中的應(yīng)用

李勇，夏俊，徐國茂，趙薇娜，于學(xué)紅

（江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西 南昌 330029）

食品安全是當(dāng)今社會的熱點(diǎn)話題，隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對食品安全越加關(guān)注，不斷頻發(fā)的食品安全事件[1～3]，如2011年雙匯“瘦肉精”事件、臺灣“塑化劑”事件，2013年新西蘭奶粉檢出雙氰胺、廣東鎘大米事件，這些都促使我們加強(qiáng)食品安全的檢測。微生物既是食品安全風(fēng)險(xiǎn)因素的其中之一，2013年俄中部城市彼爾姆因食物受沙門氏菌污染，致使近150名中學(xué)生中毒。同時(shí)也為確保食品安全發(fā)揮著積極作用，很多國家檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)都采用微生物法來檢測食品中的藥物殘留。本文對微生物在食品安全檢測中應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 微生物檢測藥物殘留

1.1 微生物法

依據(jù)試驗(yàn)原理，微生物測定法[4～5]可分為稀釋法、瓊脂擴(kuò)散法和比濁法。瓊脂擴(kuò)散法也叫管碟法，是微生物法中最常用的方法，抗生素管碟法是利用抗生素能在均勻涂布有待定試驗(yàn)菌的固體平板內(nèi)呈球面形擴(kuò)散，使得抗生素濃度在一定區(qū)域內(nèi)呈球形遞減，因此抑制了試驗(yàn)菌的繁殖，在固體平板出現(xiàn)透明的抑菌圈。此方法依據(jù)抗生素在一定濃度內(nèi)，其劑量與抑菌圈的直徑呈線性相關(guān)，通過標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品形成抑菌圈大小的比較，就可以計(jì)算出待測樣品的效價(jià)。管碟瓊脂擴(kuò)散法的種類很多，主要有微生物拭子法、德國三碟實(shí)驗(yàn)法、歐盟四碟實(shí)驗(yàn)法等，并且很多已經(jīng)商品化[6～7]。上述方法符合食品安全和食品營養(yǎng)法典委員會對快速篩選法的要求，能快速、靈敏進(jìn)行大批量的樣品檢測，操作簡便，同時(shí)可以檢出最高殘留限量的樣品藥物殘留。用微生物檢測法快速檢測藥物殘留時(shí)會產(chǎn)生一定的假陽性，這在一定范圍內(nèi)是可以接受的，如發(fā)現(xiàn)假陽性，可進(jìn)一步用儀器檢測進(jìn)行確證。李延華[8]等利用嗜熱脂肪芽孢紙片法（BSDA）、TCC法和試管擴(kuò)散法對牛乳中的三種β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)試管擴(kuò)散法可以作為BSDA和TCC法的補(bǔ)充，具有經(jīng)濟(jì)省時(shí)、簡便易行、檢出限較低的優(yōu)點(diǎn)?？梢詮浹a(bǔ)度BSDA和TCC法的缺陷，建議采用試管擴(kuò)散法作為補(bǔ)充,應(yīng)用于牛乳中β-內(nèi)酞胺酶檢測。

1.2 抗生素殘留的微生物檢測法

由于抗生素能夠抑制微生物的生長，抗生素殘留的微生物檢測法首先要篩選出對抗生素敏感的實(shí)驗(yàn)菌，根據(jù)實(shí)驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈大小與抗生素濃度成正相關(guān)來測定待測樣品的抗生素殘留。該方法由于不需特殊設(shè)備，前處理簡單，劑量關(guān)系良好，能同時(shí)篩選大批量的樣品，是最常見的篩選方法。我國農(nóng)業(yè)部第236號公告[9]就采用微生物法檢測動(dòng)物性食品中苯哇西林和青霉素類抗生素殘留，邢應(yīng)壽等[10]以藤黃微球菌為指示菌，研究了雞肉中環(huán)丙沙星殘留的微生物檢測法，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.12～1.92 μg/mL，r=0.998，環(huán)丙沙星在肌肉、肝臟和腎臟中的最低檢測限分別為0.025μg/g、0.30μg/g、0.03μg/g，該方法的精密度良好，變異系數(shù)在15%以內(nèi)，具有較大的真實(shí)度，回收率大于70%，可用于此類藥物殘留的檢測。李娜[11]采用微生物法對雞組織中三種聚醚類抗生素殘留進(jìn)行了研究，結(jié)果表明同一種藥物的最低檢測限在不同菌種條件下會發(fā)生變化。莫能菌素的最低檢測限在1.0～2.0μg/mL之間、馬杜霉素的最低檢測限分布在1.5～2.5μg/mL之間、鹽霉素的最低檢測限分布在0.25～2.0μg/mL之間，且線性良好，能夠適用于上述藥物的篩選。

綜上所述，抗生素殘留微生物檢測方法劑量關(guān)系良好，抑菌圈與實(shí)際藥物含量的相關(guān)性高，應(yīng)用范圍廣，操作簡單，不需要大型儀器，檢測成本較低，可以大批量篩選，對其進(jìn)行研究是很必要的，目前，微生物法的主要研究進(jìn)展以抗生素為主。

2 微生物法快速篩查藥物殘留

2.1 采用微生物抑制法可以快速檢測動(dòng)物源性食品的抗生素殘留,由于檢測成本低，條件簡單，并可以快速高效的大批量檢測多種抗生素，特別適合養(yǎng)殖場和基層實(shí)驗(yàn)室使用。王志強(qiáng)[12]等利用5種測試菌株對雞肉、豬肉、魚肉、蝦肉中抗生素最低檢出量分別進(jìn)行測試，結(jié)論顯示：在15～18h內(nèi)15中抗生素檢測靈敏度好，最低檢出限量在0.0025～0.05mg/kg之間，此法對養(yǎng)殖業(yè)常使用的抗生素均有良好的敏感性，最低殘留檢出限均達(dá)到我國農(nóng)業(yè)部第235號文件《動(dòng)物源性食品中獸藥最高殘留限量》的限量要求。隨著微生物法研究的深入，微生物法與其它方法相互交叉，彼此滲透，對促進(jìn)藥物殘留檢測具有重要意義。鄭晶[13～14]對微生物抑制法與酶聯(lián)免疫法檢測鰻魚中喹諾酮類藥物殘留進(jìn)行綜合評估，結(jié)果表明微生物抑制法較酶聯(lián)免疫方法更適用于整類藥物的檢測,酶聯(lián)免疫法靈敏度更高一些，兩種方法均適用于喹諾酮類藥物殘留樣品的快速篩選檢測。

2.2 高通量篩選(Highthroughputscreening)技術(shù)以微板作為實(shí)驗(yàn)載體，運(yùn)用計(jì)算機(jī)自動(dòng)化操作試驗(yàn)過程及數(shù)據(jù)分析，在同一時(shí)間可檢測大量的樣品，具有快速、微量、靈敏和準(zhǔn)確等特點(diǎn)，是未來篩選方法的發(fā)展方向。

劉興泉[15～16]等采用采用高通量微生物法，以嗜熱脂肪芽孢桿菌為指示菌，建立了雞蛋中土霉素、四環(huán)素、金霉素和新霉素的檢測方法，檢測限為0.08～0.16 mg/kg。采用96孔微板進(jìn)行抗生素殘留的微生物篩選檢測，可以在一個(gè)板上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品檢測，在4～5h內(nèi)即可篩選出幾十個(gè)樣品，具有快速高效的特點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用，是對微生物法檢測藥物殘留新的拓展，值得繼續(xù)研究與開發(fā)。

2.3 微生物檢測已經(jīng)向半定量和定量方向發(fā)展，并且不斷走向成熟，很多已經(jīng)取得國家認(rèn)可，2002年頒布蜂蜜中青霉素的含量采用微生物法[17]，其檢測范圍:0.025～0.20mg/kg。農(nóng)業(yè)部2003年1月22日發(fā)布第236號公告，發(fā)布了12個(gè)食品中獸藥殘留檢測方法，第九法為動(dòng)物性食品中青霉素類抗生素殘留檢測方法-微生物法，該方法明確指出適用于雞的肌肉、肝臟和腎臟中青霉素類抗生素殘留的檢測。王大菊等[18]以藤黃八疊球菌（Sarcinalutea）為工作菌,用杯碟法測定氨芐青霉素在豬和肉雞組織中的殘留。結(jié)果表明,氨芐青霉素在磷酸鹽緩沖液、肌肉和脂肪、肝臟和腎臟中的最低檢測限分別為0.00125μg/mL、0.00625μg/g和0.0125μg/g。溫芳[19]等以支氣管炎博代特氏菌(Bordetellabronchiseptica)ATCC4617作為檢測菌株來檢測硫酸粘桿菌素，結(jié)果證明在肌肉、肝臟和腎臟組織中，標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.025～6.4μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r分別為0.9970、0.9994、0.9990，n=9，硫酸粘桿菌素檢測限肌肉組織為0.15μg/g,肝臟和腎臟組織均為0.20μg/g，低于農(nóng)業(yè)部和歐盟規(guī)定的粘桿菌素最高殘留限量，說明微生物多藥物殘留的檢測已經(jīng)大大擴(kuò)展，目前主要研究方向?yàn)?，一是敏感菌株的篩選，二是定量準(zhǔn)確性及應(yīng)用范圍的研究。

2008年發(fā)布的進(jìn)出口標(biāo)準(zhǔn)[20～21]采用了微生物抑制法檢測動(dòng)物源性食品中β-內(nèi)酰胺類藥物殘留。可應(yīng)用于青霉素類和頭孢噻呋等藥物殘留的篩選檢測，牛奶中青霉素類方法檢測限在4～20μg/kg，頭孢噻呋為100μg/kg，肉類、魚和蝦中的檢測限高于牛奶，如發(fā)現(xiàn)陽性，結(jié)果需應(yīng)用其他方法進(jìn)行確證。

由衛(wèi)生部發(fā)布的乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗(yàn)方法同樣采用對藤黃微球菌敏感杯碟法，利用此方法的檢出限為4u/mL。這對藥物殘留的檢測起了很大的促進(jìn)作用，是確保食品安全的一道封鎖線。微生物學(xué)方法是目前用于藥物殘留最普通的非儀器方法。

3 微生物法藥物檢測的影響因素

賀微、高曄[22]采用正交試驗(yàn)法研究了羅紅霉素微生物檢定法的最佳實(shí)驗(yàn)條件，平皿分成上下兩排，上排先滴加低濃度標(biāo)準(zhǔn)液，下排按逆時(shí)針方向滴樣，加完菌層下后排平皿轉(zhuǎn)180°，滴樣量用移液器定量滴樣為最佳實(shí)驗(yàn)，根據(jù)文獻(xiàn)[23]報(bào)道及操作經(jīng)驗(yàn)，微生物菌懸液濃度，培養(yǎng)基的成分，培養(yǎng)基的厚度，檢測方法，加樣方法等都會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有重大影響。包紅朵等[24]綜述了影響微生物法測定藥物殘留靈敏度的主要因素，分別為工作菌種的選擇,菌液濃度的確定,載藥量的工具,培養(yǎng)基的成分、厚度、pH,方法制定過程中空白組織樣的選擇,并指出要對篩選出的敏感菌株要進(jìn)行保護(hù)，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基的組分,通過添加輔助成分，提高培養(yǎng)基的顯示靈敏度，從而提高微生物加測藥物殘留的準(zhǔn)確度。

4 微生物檢測存在的問題及展望

目前，食品中藥物殘留的主要檢測方法以儀器分析[25～26]為主，此法投入較大，前處理復(fù)雜，對檢測人員的要求高，難以大批量檢測。其它輔助方法有生化免疫分析法，專一試劑盒檢測，上述方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。

判斷一個(gè)藥物殘留[27]篩選方法是否可靠，需要看它能否同時(shí)分析大量樣品，并且經(jīng)濟(jì)效益具顯著。更加需要有定量性質(zhì),即假陰性率應(yīng)小于5%。定量方法通常分為第一定量法和第二定量法，第一定量方法有微生物法、抗原抗體結(jié)合法和化學(xué)法三種或三種結(jié)合方法，原則上要求在允許量濃度范圍測定結(jié)果應(yīng)可靠,可以提高方法的通用性。第二定量方法一般用于確證第一定量方法。它用測定的標(biāo)準(zhǔn)品作為參考標(biāo)準(zhǔn)。有時(shí)確證法只需要色層反應(yīng)或瓊脂板上的抑菌圈即可,只作為確證，不作進(jìn)一步深入研究。目前應(yīng)用最多的確證技術(shù)液相和質(zhì)譜,質(zhì)譜用于鑒定母體離子或碎片離子的質(zhì)量?，F(xiàn)在質(zhì)譜的發(fā)展以相液和氣相色譜聯(lián)用為主，高分辨質(zhì)譜的出現(xiàn)將大大擴(kuò)展其應(yīng)用范圍。

目前，微生物法多用于篩選，定量方法以儀器分析為主，檢測方向主要以抗生素為主，應(yīng)用范圍受到一定限制。所以未來微生物法的發(fā)展方向主要有：一是篩選更加廣泛的菌株，并進(jìn)行優(yōu)化和保存；二是改變培養(yǎng)基組分，使得定量更加精確，易于觀察，如改變培養(yǎng)基顏色的輔助物質(zhì)；三是與其它技術(shù)交叉，實(shí)現(xiàn)微生物反應(yīng)器的產(chǎn)業(yè)化，如高通量技術(shù)，酶酶聯(lián)免疫法等，使得操作更加簡便易行。

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