基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜在血培養(yǎng)陽性標(biāo)本鑒定方面的應(yīng)用進(jìn)展

趙冠華，張霄霄，汪定成，董 軻 綜述，張惠中 審校(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院檢驗科，西安 710032)

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基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜在血培養(yǎng)陽性標(biāo)本鑒定方面的應(yīng)用進(jìn)展

趙冠華，張霄霄，汪定成，董 軻 綜述，張惠中△審校(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院檢驗科，西安 710032)

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜； 血培養(yǎng)； 鑒定

如今，隨著抗菌藥物特別是廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥問題已逐漸成為全球性問題。怎樣及時而有效地選擇抗菌藥物成為臨床醫(yī)生面臨的一個難題。特別是在菌血癥或是膿毒癥等嚴(yán)重感染患者中，早期選用敏感抗菌藥物可以有效降低病死率[1]。但傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定多采用手工法，依靠形態(tài)學(xué)、革蘭染色鏡檢和生物化學(xué)反應(yīng)，速度慢，不能滿足臨床診斷和治療的需要。近年來新發(fā)展起來的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)為細(xì)菌鑒定帶來了新的進(jìn)展，特別是MALDI-TOF MS技術(shù)對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本直接鑒定的應(yīng)用，可以將原有血培養(yǎng)陽性標(biāo)本的鑒定時間由24～48 h縮短為幾十分鐘(含標(biāo)本預(yù)處理所用的時間)，為臨床用藥提供了更及時的指導(dǎo)。本文就MALDI-TOF MS在血培養(yǎng)陽性標(biāo)本鑒定方面取得的進(jìn)展予以綜述。

1 MALDI-TOF MS技術(shù)直接鑒定血培養(yǎng)標(biāo)本

1.1 細(xì)菌的鑒定 臨床上送檢的血培養(yǎng)標(biāo)本多來自血液或是無菌部位的體液，培養(yǎng)陽性一般意味著患者感染嚴(yán)重，需要及時治療。但是微生物實驗室常規(guī)采用的傳統(tǒng)手工方法或是借助半自動儀器，都需要24～48 h才能對病原菌進(jìn)行鑒定，影響臨床及時選用有效的抗菌藥物。

La Scola和Raoult[2]首先在2009年提出用三氟乙酸或蟻酸裂解菌體蛋白質(zhì)的方式直接檢測血培養(yǎng)陽性的標(biāo)本。在使用三氟乙酸處理后，對于562例只包含一種病原菌的血培養(yǎng)陽性標(biāo)本，有370例(66%)可以被正確識別。但是對草綠色鏈球菌的鑒別能力較差，大多不能鑒定，鑒定出的1例也被證明是假陽性。而對于22例含有兩種或兩種以上不同的細(xì)菌的陽性血培養(yǎng)標(biāo)本，有18例標(biāo)本鑒定出了一種細(xì)菌，2例標(biāo)本不能鑒別，另外2例標(biāo)本鑒別錯誤。

隨后，大量的研究表明，MALDI-TOF MS可以直接對血培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行鑒定，從而省去了轉(zhuǎn)種于培養(yǎng)基上孵育的時間。Romero-Gomez等[3]和Meex等[4]均認(rèn)為MALDI-TOF MS對革蘭陰性細(xì)菌的鑒別能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于對革蘭陽性菌的鑒別能力。Romero-Gomez等[3]采用MALDI-TOF MS對324例單一菌血癥血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行鑒定，其中革蘭陰性菌257株，革蘭陽性菌67株。MALDI-TOF MS可以直接鑒定腸桿菌的有97.7%，非發(fā)酵革蘭陰性桿菌的有75%，金黃色葡萄球菌的有75.8%，凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)和腸球菌的有63.3%。Meex等[4]認(rèn)為對于含有單種細(xì)菌標(biāo)本的革蘭陽性菌，Sepsityper試劑盒和使用皂角苷處理在種的水平可以正確鑒定58%和52%的細(xì)菌。對革蘭陰性菌，MALDI-TOF MS的Sepsityper試劑盒和皂角苷的方法分別可以在82.5%和90%的水平正確鑒定到種。

針對文獻(xiàn)報道的MALDI-TOF MS對葡萄球菌和鏈球菌的鑒定可信度較差的問題，多個研究也已經(jīng)進(jìn)行了探索。Dupont等[5]、Kilic和Baysallar[6]以及Lopez等[7]使用MALDI-TOF MS針對特定細(xì)菌的鑒別進(jìn)行了研究。Dupont等[5]對臨床分離的20種234株CNS用MALDI-TOF-MS、Phoenix和VITEK-2 三種系統(tǒng)分別鑒定，鑒定的總體正確率分別為93.2%、75.6%和75.2%。Kilic和Baysallar[6]認(rèn)為對于研究中69例患者的96個含革蘭陽性球菌的血培養(yǎng)陽性標(biāo)本，MALDI-TOF MS可以對金黃色葡萄球菌鑒定到屬和種的水平為100%，對CNS鑒定到屬和種的水平為96.6%。Lopez等[7]比較了MALDI-TOF MS和API20系統(tǒng)對草綠色鏈球菌的鑒別能力，對124例含草綠色鏈球菌的血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)，API20系統(tǒng)和MALDI-TOF系統(tǒng)鑒定到種的準(zhǔn)確性分別為60.5%和73.4%，鑒定到屬的準(zhǔn)確性分別為70%和94.3%。

Justesen等[8]和Bess等[9]則分別對MALDI-TOF MS鑒別厭氧菌和空腸彎曲菌屬的情況作了研究。Justesen等[8]對13個屬(主要是擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌、梭桿菌屬、乳桿菌屬、韋榮菌屬、痤瘡丙酸桿菌等)39個種的120例含厭氧菌的標(biāo)本進(jìn)行了鑒定，MALDI-TOF MS可以準(zhǔn)確鑒定到種的水平分別為70例(58.3%)和60例(50%)。Bess等[9]用傳統(tǒng)方法、分子生物學(xué)方法(實時PCR測序)和MALDI-TOF MS方法對1 007例含空腸彎曲菌的臨床標(biāo)本進(jìn)行鑒定，并把分子生物學(xué)方法作為金標(biāo)準(zhǔn)。MALDI-TOF MS方法鑒定空腸彎曲桿菌空腸亞種的準(zhǔn)確性為99.4%，空腸彎曲桿菌空腸亞種以外的空腸彎曲菌的準(zhǔn)確性達(dá)到了100%。

對于不同研究中，MALDI-TOF MS方法對細(xì)菌鑒定準(zhǔn)確率不同的原因，目前尚缺乏明確的觀點。有文獻(xiàn)認(rèn)為不同的儀器和系統(tǒng)也可能對MALDI-TOF MS的鑒別能力產(chǎn)生影響。Chen等[10]對法國生物梅里埃Vitek MS IVD和布魯克道爾頓的Microflex LT Biotyper兩種系統(tǒng)直接鑒定血培養(yǎng)陽性標(biāo)本的情況進(jìn)行比較，兩種系統(tǒng)都聯(lián)合應(yīng)用Sepsityper試劑盒，對于181例單一病原菌的血培養(yǎng)陽性標(biāo)本，Biotyper系統(tǒng)和Vitek MS IVD系統(tǒng)分別鑒定到種屬的水平為177株(97.8%)和167株(92.3%)。通過兩個系統(tǒng)對病原菌的鑒定，作者認(rèn)為Biotyper系統(tǒng)比Vitek MS IVD系統(tǒng)有更準(zhǔn)確的鑒定能力(P=0.016)。

現(xiàn)有的文獻(xiàn)表明，MALDI-TOF MS技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行直接鑒定，為臨床的診治提供快速、可靠的依據(jù)。各個研究間MALDI-TOF MS技術(shù)對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本直接進(jìn)行鑒定的準(zhǔn)確性不同是由多種因素引起的，如樣本量的大小、研究中各種病原菌所占的比例、預(yù)處理試劑和程序的差別、使用不同的系統(tǒng)等。另外，許多試驗只對限定的一種或多種病原菌進(jìn)行鑒定，缺少盲法也會對結(jié)果產(chǎn)生不同程度的影響。

1.2 真菌的鑒別 由于免疫抑制劑的大量使用和臨床收治危重患者的增多，真菌感染在臨床送檢標(biāo)本中也不斷增加。MALDI-TOF MS技術(shù)的不斷發(fā)展也實現(xiàn)了直接對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中真菌的鑒定。Marinach-Patrice等[11]較早嘗試直接從陽性血培養(yǎng)標(biāo)本中鑒定酵母菌，以減少1～3 d轉(zhuǎn)種培養(yǎng)時間對臨床調(diào)整治療帶來的不利影響。Marinach-Patrice等[11]先將白色念珠菌接種于血培養(yǎng)瓶，再用MALDI-TOF MS對標(biāo)本進(jìn)行分析，以建立質(zhì)譜指紋數(shù)據(jù)庫。最后用單獨的模擬血液培養(yǎng)陽性的36個標(biāo)本(屬于6個菌種)進(jìn)行驗證，初步證實了方法的可行性。

隨后有文獻(xiàn)報道，MALDI-TOF MS可以很好地對含真菌的血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行鑒別。Yan等[12]對42例含單種酵母菌的血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行了鑒定，認(rèn)為MALDI的Biotyper系統(tǒng)加上應(yīng)用Sepsityper標(biāo)本處理程序可以正確識別42例標(biāo)本到種的水平，包括28株(66.7%)白色念珠菌、8株(19%)近平滑念珠菌，5株(11.9%)熱帶念珠菌和1株(2.4%)新型隱球菌。除此之外，還摸索出了血培養(yǎng)中酵母的直接檢測低限為5.9×105CFU/mL(種內(nèi)變異系數(shù)為1.8%～3.6%，種間變異系數(shù)為2.9%)。Spanu等[13]對羅馬的2個生物實驗室進(jìn)行的觀察性研究表明，MALDI Biotyperr系統(tǒng)可以對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中的酵母菌直接在種的水平鑒定，研究中MALDI-TOF MS正確鑒定了195株白色念珠菌中的187株(95.9%)，148株非白色念珠菌中的128株(86.5%)。Yaman等[14]將MALDI-TOF MS與常規(guī)方法聯(lián)合自動化Vitek 2 YST板進(jìn)行對比，對281例血培養(yǎng)陽性的念珠菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS可以在種的水平100%正確鑒定281株臨床分離的念珠菌。

有文獻(xiàn)報道，MALDI-TOF MS對臨床標(biāo)本中絲狀真菌的鑒別正確率達(dá)到85.9%[15]。但對于MALDI-TOF MS直接鑒定血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中的絲狀真菌，目前文獻(xiàn)報道的相對較少，這可能是由于血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中分離的絲狀真菌數(shù)量和種類較少，缺乏相關(guān)的研究造成的。

2 直接檢測細(xì)菌的耐藥性

MALDI-TOF MS技術(shù)應(yīng)用于臨床病原菌的檢測后，不能對病原菌進(jìn)行藥敏檢測成為其明顯的不足。但隨后不斷有文獻(xiàn)報道通過各種改良方法直接對病原菌進(jìn)行藥敏測定。目前，對血培養(yǎng)陽性細(xì)菌直接進(jìn)行耐藥性的鑒定主要集中在β-內(nèi)酰胺酶活性和對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性檢測。Neumaier等[16]將氨芐西林作為耐β-內(nèi)酰胺酶活性大腸桿菌菌株的替代指標(biāo)，通過將血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中的菌液與氨芐西林培養(yǎng)液共同培養(yǎng)后，用MALDI-TOF MS區(qū)分耐氨芐西林的大腸桿菌，精度高達(dá)100%，這種方法也得到了認(rèn)可。Sparbier等[17]通過將血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中的少量菌液(1 mL)經(jīng)過Sepsityper配套試劑盒處理后，與相應(yīng)的抗菌藥物培養(yǎng)液(大腸桿菌用氨芐西林、肺炎克雷伯菌用厄他培南)共同培養(yǎng)3 h，通過質(zhì)譜儀測定兩種細(xì)菌的峰值并與標(biāo)準(zhǔn)對比來判斷其β-內(nèi)酰胺酶活性。Oviano等[18]對141例(13例菌血癥、128例接種了臨床分離菌)血培養(yǎng)陽性的標(biāo)本進(jìn)行了研究，通過使用抗菌藥物頭孢噻肟、頭孢他啶來判斷細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶的活性，研究中添加了克拉維酸以排除非耐藥機(jī)制的存在。通過測量峰譜，對血培養(yǎng)腸桿菌科細(xì)菌中ESBL檢測的靈敏度高達(dá)99%。Carvalhaes等[19]對100例隨機(jī)選擇的血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在與抗菌藥物共同孵育4 h后，可以檢測29例碳青霉烯類耐藥標(biāo)本中的21例，正確率達(dá)72.4%，特別是對于KPC-2基因和SPM-1基因所編碼耐藥性的菌株，達(dá)到100%。而對于OXA-23基因編碼的鮑曼不動桿菌菌株雖然不能在第1天發(fā)現(xiàn)，但可以對其轉(zhuǎn)種培養(yǎng)的菌株全部正確檢測。

3 MALDI-TOF MS技術(shù)對臨床指導(dǎo)意義的研究

MALDI-TOF MS技術(shù)對于臨床病原菌鑒定的重要性就在于可以及早對細(xì)菌進(jìn)行鑒定，指導(dǎo)臨床的用藥。但是由于目前推廣的主要是對病原菌種類進(jìn)行鑒別，不能直接進(jìn)行藥物敏感試驗。對檢測結(jié)果的提速對于臨床指導(dǎo)的重要性尚存在一些疑問。部分文獻(xiàn)針對MALDI-TOF MS的引入是否可以縮短經(jīng)驗性廣譜抗菌藥物的持續(xù)時間和是否有利于更快治療患者進(jìn)行了相關(guān)研究。Glans等[20]研究了實驗室引入MALDI-TOF MS前后兩個階段的情況并進(jìn)行了分析。引入前有42例患者的60例血培養(yǎng)陽性標(biāo)本納入了分析，引入后有57例患者的80例血培養(yǎng)陽性標(biāo)本納入了分析。通過分析細(xì)菌鑒定對臨床用藥的影響后發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者開始經(jīng)驗性治療時使用一種廣譜抗菌藥物，使用MALDI-TOF MS進(jìn)行細(xì)菌鑒定后，發(fā)送的報告縮短了感染患者的廣譜抗菌藥物治療時間，與革蘭陰性菌相比，革蘭陽性菌縮短的時間更明顯(從18.6 h減少到10.5 h)。同時，MALDI-TOF MS的使用，也能夠更快地判斷血培養(yǎng)陽性是否只是一種污染，從而終止非必要的治療。Hodiamont等[21]通過對73例連續(xù)血培養(yǎng)陽性的患者用藥情況進(jìn)行分析后得出結(jié)論，MALDI-TOF MS對病原菌的鑒定結(jié)果可以使多達(dá)29%的患者用藥得到調(diào)整，因此可以作為臨床診治的有效輔助診斷技術(shù)。Clerc等[22]對革蘭陰性菌的菌血癥患者進(jìn)行了前瞻性的研究，認(rèn)為對于超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)和多重耐藥低流行的革蘭陰性菌的地區(qū)，MALDI-TOF MS對血培養(yǎng)陽性的革蘭陰性菌血癥的鑒定可以使多達(dá)35.1%(71/202)的患者用藥得到調(diào)整。

總的來說，這種與臨床相關(guān)的研究有很大實用價值，對MALDI-TOF MS的推廣使用也更有說服力。但目前相關(guān)研究還比較少，降低了其證據(jù)的支持力。與之相比，大規(guī)模多中心的臨床研究，特別是包含治療費用、住院時間等綜合因素的研究，更有指導(dǎo)性。

4 MALDI-TOF MS相關(guān)的探索性研究

4.1 預(yù)處理方法的比較 各篇文獻(xiàn)所報道的對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本直接鑒別的正確鑒別能力不同，可能與血培養(yǎng)陽性標(biāo)本預(yù)處理方法不同相關(guān)。Saffert等[23]評估了分析前差速離心、10%烷基硫酸鈉(SDS)和Sepsityper試劑盒3種預(yù)處理方法處理血培養(yǎng)陽性標(biāo)本對于MALDI-TOF MS鑒定細(xì)菌的影響。鑒定屬和種的臨界值分別取系統(tǒng)規(guī)定的分?jǐn)?shù)1.700～1.999和大于或等于2.0。通過差速離心處理的79例血培養(yǎng)陽性標(biāo)本鑒定到屬和種的水平正確例數(shù)分別為51例(65%)和34例(43%)。用SDS和Sepsityper試劑處理的101例標(biāo)本鑒定到屬的水平均為77例(76%)，鑒定到種的水平分別為49例(49%)和54例(54%)。

4.2 混合菌鑒定 MALDI-TOF MS應(yīng)用于臨床細(xì)菌的鑒別以來，大量的文獻(xiàn)都表明這種技術(shù)尚不能用于混合細(xì)菌的鑒定。而Wenzel等[24]則在研究中使用新的方法和計算程序為實時檢測混合細(xì)菌標(biāo)本提供了可能。其先制備了不同比率的細(xì)菌混合物，使用MALDI-TOF MS(Biotyper 2.0)軟件分析。同時，用一種新的程序比對混合細(xì)菌的質(zhì)譜圖，建立混合細(xì)菌相關(guān)數(shù)據(jù)庫，一些兩種細(xì)菌混合生長的標(biāo)本，包括人工制備和血培養(yǎng)得到的標(biāo)本，在使用新建立的混合菌的數(shù)據(jù)庫和計算程序后，可以被正確鑒別。這項研究提出了應(yīng)用新的計算程序和新的數(shù)據(jù)庫直接檢測混合感染的血培養(yǎng)標(biāo)本的新思路。

4.3 探索最小鑒別濃度 Maier等[25]通過在血培養(yǎng)瓶中接種細(xì)菌或酵母的方法探索MALDI-TOF MS可以直接鑒定血培養(yǎng)標(biāo)本中的最低濃度。使用MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀聯(lián)合Biotyper軟件對標(biāo)本進(jìn)行鑒定，可以鑒別濃度為107CFU/mL或以上的標(biāo)本。對于不同種類的細(xì)菌(大腸桿菌、革蘭陰性非發(fā)酵菌、葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌、嗜血桿菌)均能可靠鑒定。先前文獻(xiàn)報道的不能檢測酵母菌的情況在研究中顯示可以鑒定。在某些情況下，甚至有可能在血培養(yǎng)陽性報警1～2 h前準(zhǔn)確鑒定，顯示出較高的靈敏度。但在大多數(shù)情況下，混合培養(yǎng)的病原菌仍然不能鑒別或只有一種鑒別結(jié)果。

4.4 比較延遲檢測的影響 Schieffer等[26]采用MALDI-TOF MS聯(lián)合Sepsityper試劑盒通過延遲對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本處理的辦法，模擬在室溫條件下可否將標(biāo)本送到另一個實驗室進(jìn)行檢測。試驗表明，延遲對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本的處理沒有影響Sepsityper提取標(biāo)本或MALDI-TOF MS對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本直接鑒定的準(zhǔn)確性。研究表明在臨床上，可以在室溫下將標(biāo)本送到另外的實驗室進(jìn)行檢測。

5 前景與展望

作為一種新興的診斷方法，MALDI-TOF MS技術(shù)在國外正在推廣，而在國內(nèi)的應(yīng)用還不是非常廣泛。從文獻(xiàn)報道的情況來看，對各種標(biāo)本的預(yù)處理和操作程序缺乏統(tǒng)一的規(guī)范，對菌種鑒定的準(zhǔn)確性缺乏統(tǒng)一的意見。像其他新興的診斷技術(shù)一樣，MALDI-TOF MS不能完全取代手工方法和傳統(tǒng)技術(shù)對于病原菌的鑒定。特別是在直接鑒定血培養(yǎng)陽性標(biāo)本方面，其準(zhǔn)確性和可靠性還需要臨床檢驗工作的進(jìn)一步驗證。但是，這項技術(shù)對于病原菌鑒定的發(fā)展意義重大。直接鑒定血培養(yǎng)陽性標(biāo)本帶來的時間效益已是不爭的事實，對于臨床治療的重要性和帶來的經(jīng)濟(jì)效益已在研究之中。對于臨床上遇到的一些苛養(yǎng)菌或是罕見的致病菌，MALDI-TOF MS的引入可以方便快捷地進(jìn)行鑒定。如Holler等[27]在2011年報道了1例軟弱貧養(yǎng)菌導(dǎo)致的心內(nèi)膜炎，此后，陸續(xù)有文獻(xiàn)報道了類鼻疽伯克菌[28]、紐氏放線菌[29]、涅斯捷連科菌[30]、香港鷗桿菌[31]、貪銅菌[32]等導(dǎo)致的菌血癥。這對在臨床工作中一些常規(guī)方法不能鑒定的病原菌標(biāo)本提供了新的思路。目前，MALDI-TOF MS在細(xì)菌耐藥性直接檢測的功能已經(jīng)嶄露頭角，對混合細(xì)菌的檢測也有望成為現(xiàn)實。相信隨著數(shù)據(jù)庫的不斷完善、軟件的不斷更新、影響因素的不斷明確，MALDI-TOF MS可以為臨床提供更快、更準(zhǔn)的信息，為臨床醫(yī)療提供參考。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.069

A

1672-9455(2015)18-2801-04

2015-03-16

2015-04-12)

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