張作秀
(格爾木市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,青海 格爾木 816099)
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是一種常用的固相酶免疫測定方法,是在放射免疫分析理論的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性標(biāo)記免疫技術(shù),具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好 ,所用試劑穩(wěn)定、易保存,試驗(yàn)操作簡便,結(jié)果判斷客觀等特點(diǎn)[1]。液相阻斷ELISA用于檢測家畜血清中的口蹄疫(FMD)抗體。主要應(yīng)用于兩個(gè)方面:一是檢測FMD病毒感染,廣泛用于國際貿(mào)易中;二是監(jiān)測免疫抗體,評(píng)價(jià)FMD疫苗免疫效果,也就是疫苗免疫動(dòng)物的抗強(qiáng)毒攻擊能力[2]。液相阻斷ELISA試驗(yàn)操作雖比正向間接血凝試驗(yàn)(PHA)繁瑣,但它的精確性、穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正向間接血凝試驗(yàn)[1]。
筆者首次利用液相阻斷ELISA試驗(yàn)檢測牛羊O型口蹄疫免疫效果,檢測牛45頭份,羊45只份,現(xiàn)將檢測結(jié)果報(bào)告如下。
1.1.1 郭勒木德鎮(zhèn)的拖拉海村和阿拉爾生態(tài)畜牧業(yè)合作社分別無菌采集牛血45份,羊血45份,共計(jì)牛90份,羊90份。
1.1.2 傾斜試管靜止24h,待血清自然析出,分裝、標(biāo)記、冷藏保存運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。
1.2.1 移液器。0.2~10 uL、5~50 uL、50~200 uL、50~300uL12道移液器各一把;U型微量血凝板18塊。
1.2.2 純水儀制作純凈水。
1.3.1 從2℃~8℃冰箱取出口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒回歸室溫(20℃~25℃)30 min。該試劑盒由青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn),有效期為 6 個(gè)月,批號(hào):2014120901-3。
1.3.2 將本試劑盒配備的25倍PBST濃縮液用純凈水稀釋成1倍PBST:按1∶25倍稀釋(1份濃縮液加入24份純凈水進(jìn)行稀釋)。
1.3.3 底物溶液的配制。取一片檸檬酸-磷酸鹽片劑溶于100mL純凈水中,溶化后,取50mL本溶液,再加一片鄰苯二胺(OPD)片劑,充分溶解,分裝,避光,臨用前加每1mL底物溶液加10uL3%雙氧水。
在U型反應(yīng)板上,A1-A10孔每孔加75 uL的1xPBST和25uL被檢血清,以50uL/孔的量稀釋至1∶512;在A11孔加 50uL1xPBST和50uL標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,以50uL/孔的量稀釋至1∶1 024;A12孔和B12孔稀釋陰性對(duì)照血清,從1∶2稀釋至1∶4;E12-H12孔為病毒抗原對(duì)照。
將病毒抗原用1xPBST稀釋至1∶5的工作濃度,以50uL/孔量加入到被檢血清、陰陽性對(duì)照的每一個(gè)孔中,4孔病毒抗原對(duì)照僅加入100uL/孔稀釋好的病毒抗原。每孔加入50uL病毒抗原,封板,振蕩,置4℃冰箱過夜。
將抗原抗體混合液從U型板上按次序以50uL/孔的量移至已包被口蹄疫O型兔抗的ELISA板上,封板,37℃溫育60min。
洗板5次,甩干,以50uL/孔加口蹄疫O型豚鼠抗體工作液,封板,置37℃溫箱溫育30min。
洗板5次,甩干,以50 uL/孔加兔抗豚鼠IgGHRP工作液,封板,置37℃溫箱溫育30min.
洗板5次,直接加底物溶液每孔50uL(加底物溶液之前,按1mL底物溶液加10uL3%雙氧水),37℃溫箱溫育15min。
每孔直接加50 uL終止液,置酶標(biāo)儀上讀取OD492nm值。
設(shè)立的4孔病毒抗原對(duì)照OD492nm值均在1.0~2.0內(nèi);陽性對(duì)照效價(jià)在1∶1024滴度以內(nèi);陰性對(duì)照抗體效價(jià)<1∶8。故而本次試驗(yàn)成立。
病毒抗原4孔,棄去最高和最低OD492nm值,剩余2孔的平均值除以2,即為50%對(duì)照值,該值就表示阻斷50%反應(yīng)的對(duì)照OD492nm值即臨界值。被檢血清的OD492nm值大于臨界值的孔為陰性孔,小于等于臨界值的孔為陽性孔。若臨界值與稀釋倍數(shù)最高陽性孔的OD492nm值相同,則以被檢血清陽性孔的最高稀釋倍數(shù)作為該份血清的抗體效價(jià);若臨界值處于兩個(gè)孔之間,抗體效價(jià)取上下兩孔稀釋倍數(shù)的反對(duì)數(shù)中間值。
被檢血清抗體效價(jià)大于或等于1∶128判為口蹄疫O型抗體陽性;小于1∶128判為抗體效價(jià)陰性[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)共檢測牛血清45份,抗體陽性34份,陽性(合格)率75.6%;檢測羊血清45份,抗體陽性42份,陽性(合格)率93.3%。
此次引用液相阻斷ELISA試驗(yàn)檢測牛羊O型口蹄疫免疫抗體各45份,抗體效價(jià)均達(dá)到農(nóng)業(yè)部規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)(群體抗體效價(jià)70%)。抽檢樣品的群體均在2014年10月份注射過口蹄疫雙價(jià)苗,截止液相阻斷ELISA試驗(yàn)操作雖比正向間接血凝試驗(yàn)(PHA)繁瑣,但它的精確性、穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正向間接血凝試驗(yàn)[2]。在操作中幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)把握不好,也會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)生偏差或試驗(yàn)失敗,筆者簡要介紹液相阻斷ELISA操作中的幾點(diǎn)注意事項(xiàng)。
5.1 試劑的回溫及室溫孵育試劑盒中所有試劑,包括包被反應(yīng)板,在使用之前恢復(fù)至室溫(20℃~25℃),特別是冬季氣溫較低,充分的回溫尤為重要。室溫孵育時(shí),控制室溫在 20℃~25℃,避免在冷氣、光照、熱源或通風(fēng)口等溫度不均勻的位置進(jìn)行檢測,注意不要把反應(yīng)板直接放在冰冷的實(shí)驗(yàn)桌面上,可以墊上東西作為緩沖[3]。
5.2 反應(yīng)時(shí)間每次加樣最好按統(tǒng)一順序加,計(jì)時(shí)要準(zhǔn)確。反應(yīng)板多時(shí),要記得依次加樣。
[1]馬軍武,劉湘濤,胡弘博,等.液相阻斷ELISA檢測口蹄疫病毒抗體方法的建立[C].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全國口蹄疫學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.蘭州:中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)口蹄疫分會(huì),2003,364~368.
[2]馬軍武,林密,祁淑蕓.檢測口蹄疫Asia-Ⅰ型病毒抗體液相阻斷ELISA的特異性和敏感性[C].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全國口蹄疫學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.蘭州:中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)口蹄疫分會(huì),2005,378~380.
[3]劉穎,冉多良,王香祖.O型口蹄疫疫苗免疫家畜抗體水平的檢測[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008(10).