臨床微生物實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離接種技術(shù)的研究進(jìn)展

王敬華，葛 平，陳 蓉，徐 蓉，劉學(xué)杰

(上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海200126)

近年來(lái)，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的科技成果正不斷地被迅速應(yīng)用于醫(yī)學(xué)科學(xué)研究和臨床實(shí)踐。其中，臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)也得到快速發(fā)展，各種非培養(yǎng)快速診斷方法的建立縮短了檢驗(yàn)時(shí)間［1-2］。但作為循證醫(yī)學(xué)的直接證據(jù)，病原菌分離培養(yǎng)仍然是診斷感染性疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，也是進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)、合理選擇抗菌藥物進(jìn)行個(gè)體化抗感染治療的主要手段。作為細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定的前期基礎(chǔ)，微生物標(biāo)本接種技術(shù)得到一定發(fā)展，出現(xiàn)了商品化的自動(dòng)化、半自動(dòng)化接種儀。目前在國(guó)內(nèi)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中，以接種環(huán)手工分區(qū)劃線接種標(biāo)本方法為主，兼有自動(dòng)化、半自動(dòng)化標(biāo)本接種方法共存，尚難以進(jìn)行統(tǒng)一操作和標(biāo)準(zhǔn)化。為提高檢驗(yàn)質(zhì)量，開(kāi)展有效的標(biāo)本接種質(zhì)量控制，我們就臨床微生物實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離接種技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀和研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、目前微生物標(biāo)本接種的經(jīng)典方法

利用接種環(huán)分區(qū)劃線以獲取單個(gè)菌落是經(jīng)典的細(xì)菌接種方法，目前仍然被國(guó)內(nèi)外臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛采用。但該方法也存在一些弊端。首先，該方法對(duì)個(gè)人操作水平要求較高，不僅必須做到無(wú)菌操作，而且要通過(guò)嚴(yán)格培訓(xùn)和長(zhǎng)期操作實(shí)踐，才能獲得理想的分離效果;其次，人工接種方法總體效率低，并受操作者個(gè)人水平和接種習(xí)慣的影響，主觀影響因素較多，重復(fù)性差;另外，在整個(gè)接種過(guò)程中，標(biāo)本完全暴露于空氣中，操作者與標(biāo)本近距離接觸，自身健康受到威脅。總之，這種經(jīng)典的細(xì)菌接種方法工作效率低，難以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和實(shí)施質(zhì)量控制，無(wú)法滿足現(xiàn)代化的實(shí)驗(yàn)室對(duì)自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的要求。

二、自動(dòng)化快速接種技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

標(biāo)本接種自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化是臨床微生物實(shí)驗(yàn)室提高檢驗(yàn)質(zhì)量、開(kāi)展質(zhì)量控制的主要研究和發(fā)展的方向之一。19世紀(jì)70年代，美國(guó)已經(jīng)開(kāi)始了自動(dòng)化微生物接種儀的研究。1973年，美國(guó)埃德坎貝爾博士與美國(guó)食品藥品管理局研究員發(fā)明了螺旋接種方法自動(dòng)計(jì)算細(xì)菌的數(shù)量，并最早于1977年獲得螺旋接種儀的發(fā)明專利，于1979年與Interscience的創(chuàng)始人Fracois/Jalenque共同研發(fā)生產(chǎn)了第一代螺旋細(xì)菌接種儀，主要用于食品藥品中微生物檢驗(yàn)。1992年，他們重新校正了Spiral螺旋接種方法，并申請(qǐng)了專利，成為第一代接種儀接種原理的理論基礎(chǔ)。

迄今，自動(dòng)化接種儀研究方興未艾，自動(dòng)化快速接種技術(shù)仍然不夠成熟。目前，僅有少數(shù)幾種自動(dòng)或半自動(dòng)化微生物接種儀投放市場(chǎng)，而且多數(shù)仍處于逐步完善階段，甚至是臨床試驗(yàn)階段。因此，配備自動(dòng)化微生物接種儀的國(guó)內(nèi)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室還很少;國(guó)際范圍內(nèi)，也僅有很少大型的臨床實(shí)驗(yàn)室配備全自動(dòng)細(xì)菌分離培養(yǎng)系統(tǒng)。按照接種原理分類，現(xiàn)有自動(dòng)化接種儀均采用劃線接種的原理，能夠?qū)崿F(xiàn)半定量接種，仍然歸屬為第一代產(chǎn)品。與日趨成熟的微生物自動(dòng)化鑒定技術(shù)相比較，第一代接種儀在接種技術(shù)的諸多方面還很不成熟，有一些技術(shù)問(wèn)題尚待解決［3］。

在第一代接種儀中，以意大利Diesse公司生產(chǎn)的Robobact system全自動(dòng)微生物分離培養(yǎng)系統(tǒng)、法國(guó)Interscience公司研制的EasySpiral Pro全自動(dòng)螺旋接種儀以及法國(guó)生物梅里埃公司推出的PREVI Isola自動(dòng)化微生物接種儀最具代表性。

Robobact system全自動(dòng)微生物分離培養(yǎng)系統(tǒng)將標(biāo)本接種與平板孵育集成到一臺(tái)儀器，使用方便。采用特制的平板和簡(jiǎn)單劃線接種技術(shù)，平板面積小，無(wú)分區(qū)劃線設(shè)計(jì)，可以用于糞便、拭子、尿液標(biāo)本中病原菌的分離培養(yǎng)［4］，但不適合下呼吸道標(biāo)本，因這類標(biāo)本可能含有大量正常菌群而又需要分離培養(yǎng)其中的苛養(yǎng)菌［5］，不宜全部采用選擇性培養(yǎng)基，無(wú)分區(qū)接種難以達(dá)到分離效果。

EasySpiral Pro全自動(dòng)螺旋接種儀實(shí)現(xiàn)標(biāo)本自動(dòng)加樣、自動(dòng)接種、自動(dòng)清洗、消毒接種針等過(guò)程，其中自動(dòng)接種過(guò)程僅需25 s，除了進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，還能夠用于藥物敏感性試驗(yàn)［6-7］。但在涂布平板進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)時(shí)，有時(shí)會(huì)將瓊脂整個(gè)卷起;為防止交叉污染，每份標(biāo)本接種后都必須進(jìn)行清洗、消毒接種針，由于部分細(xì)菌對(duì)消毒劑耐藥或形成芽胞，25 s內(nèi)徹底殺滅所有細(xì)菌理論上是不可能的［8-9］;而且，高濃度消毒劑未必就能達(dá)到理想的殺菌效果，接種針還可能攜帶殘余消毒劑;由于該儀器為單臂型(一個(gè)接種通道)，每個(gè)工作循環(huán)(包括標(biāo)本更換、平板更換、吸樣、接種、清洗消毒)只能處理1份標(biāo)本，僅接種1塊平板;需要清洗、消毒和人工填充平板，自動(dòng)化操作過(guò)程難以連續(xù)進(jìn)行;特別是在操作過(guò)程中，為防止交叉污染，實(shí)際需要清洗和消毒接種針次數(shù)多、時(shí)間長(zhǎng)［9］，工作效率不高，不適于大批量標(biāo)本接種。這些因素可能是造成該儀器目前難以在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室大量推廣應(yīng)用的主要原因。

PREVI Isola自動(dòng)化微生物接種儀是目前被認(rèn)為自動(dòng)化程度最高、接種效率最高、技術(shù)最成熟的接種儀。具有自動(dòng)平板填充功能，可選擇平板、貼標(biāo)簽并記錄平板類型和接種時(shí)間等［10-12］;可精確吸取標(biāo)本，并使用接種涂布器分離接種，重復(fù)性很好，交叉污染率較低［13］;與手工法比較，平板有效利用率高，分離到單個(gè)菌落多［14］;但該接種儀不能進(jìn)行自動(dòng)化標(biāo)本杯開(kāi)蓋、關(guān)蓋，出現(xiàn)卡板現(xiàn)象可導(dǎo)致死機(jī);同批次接種不同類型標(biāo)本時(shí)，接種效率低;不適合接種導(dǎo)管、組織等［13］;接種涂布器無(wú)法將精確吸取的標(biāo)本全部接種到平板，因此事實(shí)上該儀器仍然只能做到半定量接種。PREVI Isola自動(dòng)化微生物接種儀還存在一個(gè)嚴(yán)重設(shè)計(jì)缺陷:由17個(gè)接種環(huán)并排構(gòu)成的接種涂布器呈一個(gè)平面，必須和同樣呈平面的平板表面完美結(jié)合，否則二者難以充分接觸，不僅平板有效利用率下降使分離有效性下降，而且可能導(dǎo)致接種失敗，得出假陰性培養(yǎng)結(jié)果。事實(shí)上，批量生產(chǎn)的含瓊脂平板其表面難以完全做到真正水平。美國(guó)食品藥品管理局于2012年12月發(fā)出通知，在全球范圍召回PREVI Isola自動(dòng)化微生物接種儀［15］。另外，接種儀自身制造成本較高，市場(chǎng)銷售價(jià)格昂貴;每接種1份標(biāo)本均需要更換價(jià)格不菲(20～30元人民幣)的接種涂布器，造成使用成本增加;相對(duì)于菲薄的微生物檢驗(yàn)利潤(rùn)、昂貴的儀器價(jià)格和較高的使用成本，使其難以在包括我國(guó)在內(nèi)的廣大發(fā)展中國(guó)家推廣。

有研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有自動(dòng)化接種儀均缺乏有效的自動(dòng)標(biāo)本均質(zhì)化預(yù)處理功能。而標(biāo)本均質(zhì)化效果是影響微生物檢驗(yàn)質(zhì)量的關(guān)鍵程序，也是實(shí)現(xiàn)標(biāo)本接種全程自動(dòng)化程序中的關(guān)鍵技術(shù)?，F(xiàn)有自動(dòng)化接種儀仍采用人工打開(kāi)標(biāo)本蓋、加入處理液進(jìn)行均質(zhì)化處理的傳統(tǒng)方法［13］，不僅延誤標(biāo)本接種時(shí)間、降低接種過(guò)程自動(dòng)化程度、增加標(biāo)本污染機(jī)會(huì)，而且存在實(shí)驗(yàn)室生物安全隱患。

我國(guó)開(kāi)展自動(dòng)化微生物接種技術(shù)研究的時(shí)間較短，特別是研究成果的轉(zhuǎn)化速度相對(duì)滯后，總體研發(fā)水平低于國(guó)際同行。國(guó)內(nèi)學(xué)者魏志勇等［16］研制發(fā)明了自動(dòng)化微生物接種儀，并獲得國(guó)家發(fā)明專利。與現(xiàn)今流行的螺旋接種儀不同，魏志勇發(fā)明的微生物自動(dòng)接種儀仍然采用劃線接種原理，屬于第一代自動(dòng)化接種儀。但與前述其他第一代接種儀不同，該儀器模擬手工接種，采用分區(qū)劃線的方法，有利于提高病原菌的分離效果;同時(shí)，該儀器采用紅外線加熱消毒的方法進(jìn)行接種環(huán)滅菌，使接種環(huán)的滅菌效果更可靠，較早期第一代自動(dòng)化接種儀有一定的先進(jìn)性。但目前尚未見(jiàn)其相應(yīng)儀器面世，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不詳，特別是接種速度和接種效果尚未見(jiàn)報(bào)道。

三、細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)

2001年我國(guó)衛(wèi)生部頒發(fā)了《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行)》，其中臨床實(shí)驗(yàn)室分離病原菌臨床意義的判定標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)具體量化到“cfu/mL”［17］，與《臨床微生物學(xué)操作指南》等國(guó)際診斷標(biāo)準(zhǔn)的要求是基本一致的［5］。因此，細(xì)菌定量檢驗(yàn)，尤其是條件致病菌定量檢驗(yàn)，對(duì)正確診斷和合理治療臨床最常見(jiàn)的由條件致病菌所引起的臨床感染(90%以上)［18］，具有非常重要的指導(dǎo)意義。

現(xiàn)有細(xì)菌培養(yǎng)檢驗(yàn)技術(shù)是基于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定性或半定量檢驗(yàn)，重復(fù)性差，難以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。臨床微生物實(shí)驗(yàn)室僅能對(duì)尿液標(biāo)本、導(dǎo)管進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，對(duì)來(lái)自下呼吸道的標(biāo)本做粗略的半定量檢驗(yàn)［8］，其他標(biāo)本不做定量檢驗(yàn)［5，8］，已不能滿足臨床診斷和治療的需要;基于定性或粗略半定量檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室分離菌株的臨床意義(特別是呼吸道標(biāo)本中的條件致病菌，如念珠菌屬、不動(dòng)桿菌屬和銅綠假單胞菌等)及細(xì)菌培養(yǎng)檢驗(yàn)報(bào)告的臨床診斷價(jià)值已經(jīng)愈來(lái)愈受到臨床醫(yī)師的質(zhì)疑。因此，細(xì)菌培養(yǎng)的定量檢驗(yàn)已經(jīng)成為臨床實(shí)驗(yàn)室迫切需要解決的技術(shù)難題，已經(jīng)受到包括檢驗(yàn)界專家在內(nèi)的國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。然而迄今為止，國(guó)際上尚缺乏操作簡(jiǎn)便、快捷，可用于多種標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)準(zhǔn)確定量檢驗(yàn)的方法。因此，開(kāi)展臨床微生物檢驗(yàn)標(biāo)本準(zhǔn)確定量檢驗(yàn)分析，建立細(xì)菌培養(yǎng)定量檢驗(yàn)方法，將成為臨床細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)未來(lái)新的發(fā)展趨勢(shì)。

四、自動(dòng)化微生物接種技術(shù)研究進(jìn)展與前期探討

準(zhǔn)確的標(biāo)本定量接種技術(shù)是建立細(xì)菌培養(yǎng)定量檢驗(yàn)方法的基礎(chǔ);而標(biāo)本接種自動(dòng)化是微生物檢驗(yàn)全程自動(dòng)化不可或缺的關(guān)鍵技術(shù)。因此，細(xì)菌培養(yǎng)定量檢驗(yàn)方法的建立應(yīng)當(dāng)基于先進(jìn)的標(biāo)本自動(dòng)化接種技術(shù)。由于國(guó)際上尚沒(méi)有比較理想的自動(dòng)化接種儀，特別是能夠準(zhǔn)確定量接種的自動(dòng)化儀器，缺乏先進(jìn)的研究平臺(tái)，使細(xì)菌培養(yǎng)定量檢驗(yàn)技術(shù)相關(guān)研究進(jìn)展緩慢。目前，包括法國(guó)生物梅里埃公司、法國(guó)Interscience公司等國(guó)際知名微生物檢驗(yàn)儀器和試劑生產(chǎn)商，仍然在致力于自動(dòng)化接種技術(shù)的科研攻關(guān)。

國(guó)內(nèi)王敬華等［3，19］新近發(fā)明了一種多通道自動(dòng)化微生物接種儀，探討了解決微生物標(biāo)本準(zhǔn)確定量接種的問(wèn)題，該研究創(chuàng)新了接種原理，徹底摒棄接種環(huán)和劃線接種方法。利用伯努利原理(同一流質(zhì)內(nèi)，流體流速與壓力呈反比，即流速大，壓強(qiáng)小;流速小，壓強(qiáng)大)進(jìn)行接種，因而不存在接種環(huán)污染、消毒劑攜帶、頻繁更換涂布器或涂布器與平板接觸不良等第一代接種儀所面臨的技術(shù)難題［5］;而且該儀器不配備自動(dòng)化平板填充系統(tǒng)，而是通過(guò)采用連通器原理，設(shè)計(jì)多通道接種儀，與單通道的第一代接種儀相比，10個(gè)接種通道同步工作，有望提高接種儀的實(shí)際接種效率;通過(guò)特殊設(shè)計(jì)，標(biāo)本杯已經(jīng)具備自動(dòng)化標(biāo)本均質(zhì)化預(yù)處理功能，可以節(jié)省標(biāo)本預(yù)處理時(shí)間30 min以上，且均質(zhì)化的液化標(biāo)本與標(biāo)本殘?jiān)詣?dòng)分離，保證標(biāo)本均質(zhì)化效果，為標(biāo)本的準(zhǔn)確定量接種奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)證明，在壓強(qiáng)恒定條件下，單位時(shí)間內(nèi)密閉容器內(nèi)液體通過(guò)相同孔徑導(dǎo)管的流度相同?；诹黧w力學(xué)特性，結(jié)合伯努利原理，作為定量接種的理論基礎(chǔ)，該方法有望成為自動(dòng)化標(biāo)本的準(zhǔn)確定量接種方法。前期實(shí)驗(yàn)表明，采用該接種方法所獲得的分離接種效果明顯優(yōu)于第一代接種儀。

總之，與自動(dòng)化微生物鑒定儀比較，微生物自動(dòng)化接種技術(shù)還很不成熟，在一定程度上遲滯全自動(dòng)微生物檢驗(yàn)流水線研發(fā)過(guò)程。微生物接種自動(dòng)化研究方興未艾，目前尚缺乏能夠自動(dòng)化準(zhǔn)確定量接種的檢驗(yàn)技術(shù)。開(kāi)展細(xì)菌定量檢驗(yàn)和分析是臨床診斷和治療的迫切需求，也是臨床微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域研究值得密切關(guān)注的課題之一。加快研制和開(kāi)發(fā)具有我國(guó)完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的自動(dòng)化接種儀，建立細(xì)菌培養(yǎng)定量檢驗(yàn)方法，不僅具有非常重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和科學(xué)研究?jī)r(jià)值，而且具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

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