PI3K/PKB信號通路在TGF-β1誘導人肝星狀細胞表達骨橋蛋白中的作用*

吳惠春， 李 曼， 周振華， 張 鑫， 張 斌△， 高月求, △

(1上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院肝病科， 2上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203)

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PI3K/PKB信號通路在TGF-β1誘導人肝星狀細胞表達骨橋蛋白中的作用*

吳惠春1， 李 曼2， 周振華2， 張 鑫2， 張 斌1△， 高月求1, 2△

(1上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院肝病科，2上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203)

目的： 研究磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)信號通路在轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導人肝星狀細胞表達骨橋蛋白(OPN)的調(diào)控作用。方法: 體外培養(yǎng)LX-2人肝星狀細胞株，予TGF-β1(終濃度2.5、5、10、20 μg/L)刺激24 h或予TGF-β1(終濃度10 μg/L)刺激12 h、24 h、48 h；先經(jīng)PI3K/PKB信號通路特異性抑制劑wortmannin(0.1 μmol/L)預處理1 h，再予10 μg/L TGF-β1刺激24 h，收集細胞，采用real-time PCR及Western blotting法檢測OPN表達情況。結(jié)果: TGF-β1能夠促進LX-2細胞表達OPN，在一定濃度和時間范圍內(nèi)，其表達量隨著TGF-β1濃度和時間的增加而增加，呈劑量和時間依賴性關系；經(jīng)wortmannin預處理再予TGF-β1刺激的LX-2細胞，與對照組相比，OPN表達受到明顯抑制(P<0.01)。結(jié)論: TGF-β1對LX-2人肝星狀細胞OPN表達具有誘導作用，此作用可能受PI3K/PKB信號通路的調(diào)控。

骨橋蛋白； 肝星狀細胞； 轉(zhuǎn)化生長因子β1； PI3K/PKB信號通路

骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的分泌型磷酸化糖蛋白，最早從骨基質(zhì)中分離出來而得名。近年研究表明，OPN作為細胞外基質(zhì)中一種重要的非膠原糖蛋白分子，能夠調(diào)節(jié)肉芽腫的形成，參與組織修復和纖維化的形成[1-2]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一個強有力的促肝纖維化因子，在肝纖維化發(fā)生過程中具有活化肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)、促進細胞外基質(zhì)合成與沉積等作用，是肝纖維化最重要的始動因子之一?；罨腍SC是肝纖維化時過量細胞外基質(zhì)的主要來源。本研究用TGF-β1刺激LX-2人肝星狀細胞株，并用PI3K/PKB信號通路特異性抑制劑wortmannin干預，觀察OPN表達的變化，初步探討TGF-β1對OPN表達的誘導作用及PI3K/PKB信號通路對其的調(diào)控作用。

材 料 和 方 法

1 細胞

表型活化的LX-2人肝星狀細胞株由上海復蒙生物基因公司提供。

2 主要試劑和儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基和澳洲胎牛血清購于Gibco；TGF-β1、wortmannin和兔抗人OPN抗體購于Sigma；兔抗人PKB和p-PKB抗體購于CST；Western blotting實驗所需蛋白裂解、制膠、電泳等試劑均為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；Trizol購于Invitrogen；real-time PCR反應試劑盒為Ferments產(chǎn)品；所用引物由上海生工公司設計合成，序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

生物安全柜(蘇州安泰公司)；倒置顯微鏡(OLYMPUS)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Heal Force)；Millipore實驗室純水系統(tǒng)(Pall)；水平離心機(Beckman Coulter)；低溫高速離心機和PCR儀(Eppendorf)；垂直蛋白電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)。

3 方法

3.1 細胞培養(yǎng) LX-2細胞株接種于25 mm2塑料培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當細胞生長接近于鋪滿整個瓶底時，用含0.25%胰酶和0.02% EDTA的胰酶消化液消化細胞，傳代。

3.2 細胞干預 取生長良好的細胞，接種3×105個細胞于培養(yǎng)瓶內(nèi)，待細胞生長至約鋪滿瓶底70%時開始干預。設對照組及TGF-β1干預組：對照組不加干預因素；TGF-β1干預組予加入TGF-β1(終濃度2.5、5、10、20 μg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，或者加入TGF-β1(終濃度為10 μg/L)，分別繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h。另設對照組、wortmannin+TGF-β1組、TGF-β1組及wortmannin組。對照組不加干預因素；wortmannin+TGF-β1組先予PI3K/PKB信號通路特異性抑制劑wortmannin(終濃度0.1 μmol/L)預處理1 h，再予TGF-β1(終濃度10 μg/L)刺激24 h；TGF-β1組直接予TGF-β1(終濃度10 μg/L)刺激24 h；wortmannin組予wortmannin(終濃度0.1 μmol/L)處理1 h。干預結(jié)束，收集各組細胞，檢測OPN表達。

3.3 Real-time PCR法檢測OPN mRNA表達 按照Trizol說明書提取細胞總RNA，取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄，再取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增反應。PCR反應條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共40個循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt法，以GAPDH為內(nèi)參照，進行OPN mRNA表達相對定量分析。

3.4 Western blotting法檢測蛋白表達 細胞用預冷PBS清洗2次后加入含1% PMSF的裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取等量蛋白(30 μg、10 μL)進行凝膠電泳，蛋白經(jīng)半干法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，I抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，PBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的II抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，PBST洗膜，ECL化學發(fā)光法顯影。以GAPDH為內(nèi)參照，結(jié)果用灰度值比值表示。

4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 15.0數(shù)據(jù)分析軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 不同濃度TGF-β1對LX-2細胞OPN mRNA表達的影響

在TGF-β1作用下，OPN mRNA表達明顯上調(diào)，各TGF-β1干預組的OPN mRNA相對表達量分別為1.328±0.091、1.937±0.196、2.565±0.150及2.935±0.201，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義。在實驗所選濃度范圍內(nèi)，OPN mRNA表達量與TGF-β1干預濃度呈正相關，當TGF-β1終濃度為20 μg/L時，OPN mRNA表達上調(diào)最為顯著，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of OPN in LX-2 cells induced by different concentrations of TGF-β1 for 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,** P<0.01 vs 0 μg/L group.

2 不同濃度TGF-β1對LX-2細胞OPN蛋白表達的影響

Western blotting的實驗結(jié)果顯示，對照組LX-2有少量OPN蛋白表達，經(jīng)過TGF-β1干預，其表達量明顯增加，各組與對照組相比均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。OPN蛋白表達量隨著TGF-β1干預濃度增加而增加，當TGF-β1終濃度為20 μg/L時，OPN蛋白表達增加最多，見圖2。

Figure 2.The protein expression of OPN in LX-2 cells induced by different concentrations of TGF-β1 for 24 h. Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs 0 μg/L group.

3 TGF-β1作用不同時間對LX-2細胞OPN mRNA表達的影響

LX-2細胞經(jīng)10 μg/L的TGF-β1干預12 h、24 h、48 h，各組OPN的mRNA表達均有上調(diào)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。其中，24 h組OPN的mRNA相對表達量為3.008±0.253，上調(diào)最顯著，見圖3。

Figure 3.The mRNA expression of OPN in LX-2 cells stimulated by TGF-β1 at concentration of 10 μg/L for different time. Mean±SD.n=3. ** P<0.01 vs 0 h group.

4 TGF-β1作用不同時間對LX-2細胞OPN蛋白表達的影響

LX-2細胞經(jīng)TGF-β1干預12 h，OPN蛋白表達稍有增加，24 h組及48 h組與對照組相比，OPN蛋白表達明顯上調(diào)，其中48 h組最為顯著(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.The protein expression of OPN in LX-2 cells stimulated by TGF-β1 at concentration of 10 μg/L for different time. Mean±SD. n=3.*P<0.05，** P<0.01 vs 0 h group.

5 TGF-β1對PI3K/PKB信號通路活化的影響

以終濃度為10 μg/L的TGF-β1作用于LX-2細胞株，觀察10 min、20 min、30 min及60 min時PI3K/PKB信號通路中PKB的磷酸化情況。Western blotting結(jié)果顯示，未經(jīng)TGF-β1刺激的對照組細胞有一定量p-PKB的表達，予以TGF-β1刺激后，p-PKB表達量在10 min時即開始增加，20 min時達到高峰，30 min時表達較前減少，到60 min時與對照組p-PKB表達相當，見圖5。

Figure 5.The effects of TGF-β1 at concentration of 10 μg/L on the activation of PI3K/PKB signaling pathway. Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs 0 min group;**P<0.01 vs 0 min group.

6 PI3K/PKB信號通路對TGF-β1誘導的LX-2細胞OPN mRNA表達的影響

LX-2細胞經(jīng)PI3K/PKB信號通路抑制劑wortmannin預處理1 h，再予TGF-β1刺激，與TGF-β1刺激組相比，OPNmRNA表達量明顯下調(diào)(P<0.01)，與對照組相比也有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示加入PI3K/PKB信號通路抑制劑wortmannin，可以下調(diào)但不能完全阻斷由TGF-β1所誘導LX-2的OPN mRNA的表達。Wortmannin處理1 h組與對照組相比，OPN的mRNA明顯下調(diào)(P<0.01)，見圖6。

Figure 6.The effects of PI3K/PKB inhibitor wortmannin on the mRNA expression of OPN in LX-2 cells induced by TGF-β1. Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs TGF-β1 group.

7 PI3K/PKB信號通路對TGF-β1誘導的LX-2細胞OPN蛋白表達的影響

如前所述，未經(jīng)TGF-β1刺激的對照組LX-2細胞有少量OPN蛋白表達，予以TGF-β1刺激后其表達量明顯增多(P<0.01)。經(jīng)PI3K/PKB通路抑制劑wortmannin預處理1 h后再予TGF-β1刺激的細胞，其OPN蛋白表達量介于對照組和TGF-β1刺激組之間，單用wortmannin處理1 h組，OPN蛋白表達受到明顯抑制(P<0.01)，見圖7。

Figure 7.The effects of PI3K/PKB inhibitor wortmannin on the protein expression of OPN in LX-2 cells induced by TGF-β1. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs TGF-β1 group.

討 論

肝纖維化是肝臟受到各種慢性損傷后的自我修復反應，主要表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)的過量合成與沉積。肝臟損傷時，受損細胞產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物、細胞碎片、活性氧簇及TGF-β1等細胞因子均可刺激HSC增殖與活化，使其表型發(fā)生改變，表達α-SMA，大量合成膠原等細胞外基質(zhì)。目前，普遍認為HSC的活化是肝纖維化形成的核心環(huán)節(jié)[3]。

TGF-β1是一種具有多種生物學功能的肽類生長因子，對細胞的生長、分化、細胞外基質(zhì)的聚集和免疫反應等方面有著廣泛的影響。TGF-β1是目前發(fā)現(xiàn)的最強的促纖維化因子，它與細胞表面受體結(jié)合后可通過TGF-β1/Smads及TGF-β1/PI3K/PKB途徑傳遞活化信號，進而促進HSC表型轉(zhuǎn)變、增殖及細胞外基質(zhì)的合成[4-5]。

在細胞外基質(zhì)中，除了大量的膠原成分之外，還存在一些功能獨特的非膠原成分，如OPN、纖黏連蛋白、層黏連蛋白等，這些物質(zhì)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中也有著重要作用。OPN最初由骨基質(zhì)中分離而來，是一種含有RGD序列的分泌型磷酸化糖蛋白，可由多種組織細胞合成與分泌，廣泛存在于人體多種組織。OPN結(jié)構(gòu)上與多種基質(zhì)蛋白相似，在功能上卻具有細胞因子的特點，能夠調(diào)節(jié)肉芽腫的形成，參與組織修復、纖維化的形成等[1-2]。

我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，正常大鼠肝組織OPN表達極弱，肝纖維化模型大鼠肝組織OPN表達明顯上調(diào)，兩者相比有顯著差異[6-7]。國外學者報道酒精性肝病患者血清、脂肪組織和肝臟組織中OPN的含量均高于正常人，其表達量隨著疾病的進展而升高；在肝臟，OPN的表達量與中性粒細胞浸潤、肝臟炎癥、TGF-β含量及肝纖維化程度呈正相關[8]。對慢性丙肝患者血清OPN水平與肝臟炎癥、纖維化程度作相關性分析研究，也得到了與其一致的結(jié)果[9]。有研究報道靜止的HSC基本不表達OPN mRNA，培養(yǎng)7 d和14 d后，其OPN的mRNA表達量明顯上調(diào)，Western blotting結(jié)果與其一致。重組OPN與HSC共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，OPN可引起HSC增殖與遷移，誘導MMP-2的產(chǎn)生與活化，上調(diào)I型膠原和TGF-β受體水平[10]。最新研究顯示，OPN作為一種氧化應激敏感的細胞因子，能通過αVβ3整合素結(jié)合及活化PI3K/p-Akt/NF-κB途徑上調(diào)肝星狀細胞α-SMA和Ⅰ型膠原表達，加速肝纖維化的進程[11]。為此，OPN將可能成為判斷慢性肝病纖維化進展的一個新的預測因子和生物學標志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，LX-2人肝星狀細胞株經(jīng)TGF-β1刺激OPN表達明顯上調(diào)，在一定范圍內(nèi)其上調(diào)量隨著TGF-β1濃度及作用時間的增加而增加，表現(xiàn)出了劑量和時間依賴性的關系，提示OPN上調(diào)與肝星狀細胞的活化程度密切相關。本實驗所選用的LX-2細胞株乃是表型活化的細胞，實驗結(jié)果顯示未予TGF-β1刺激的對照組細胞也有少量OPN mRNA及蛋白的表達，恰好也證實了這一點。

PI3K/PKB信號途徑是近年來研究較多的一個生長因子信號傳導途徑，越來越多的證據(jù)表明PKB與細胞的生長代謝、凋亡惡變等密切相關。在各種細胞因子作用下，PI3K活化，生成3位磷酸化的磷脂產(chǎn)物，該產(chǎn)物引起PKB與膜結(jié)合，在PDK的作用下，PKB發(fā)生磷酸化活化，活化的PKB離開細胞膜而進入胞質(zhì)和胞核，使其下游分子發(fā)生磷酸化，從而促進細胞生存、代謝、細胞骨架重組等生物學事件[12]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)未經(jīng)TGF-β1刺激的對照組細胞有少量磷酸化PKB表達，予TGF-β1刺激，磷酸化PKB表達量在10 min時即開始增加，20 min時達到高峰，30 min時表達較前減少，到60 min時與對照組磷酸化PKB表達相當，說明TGF-β1參與了對PI3K/PKB信號途徑的誘導活化過程。LX-2細胞經(jīng)PI3K/PKB特異性阻斷劑wortmannin預處理后再予TGF-β1刺激，其OPN表達與單用TGF-β1刺激組相比明顯下調(diào)，提示PI3K/PKB信號途徑對OPN表達可能有調(diào)控作用。

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Effects of PI3K/PKB signaling pathway on expression of osteopontin in human hepatic stellate cells induced by transforming growth factor-β1

WU Hui-chun1, LI Man2, ZHOU Zhen-hua2, ZHANG Xin2, ZHANG Bin1, GAO Yue-qiu1, 2

(1DepartmentofHepatopathy,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，2ShanghaiKeyLaboratoryofTraditionalChineseClinicalMedicine,Shanghai201203,China.E-mail:zhangbsh@126.com；gaoyueqiu@hotmail.com)

AIM: To investigate the regulatory effects of phosphatylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/PKB) signaling pathway on the expression of osteopontin (OPN) in transforming growth factor-β1(TGF-β1)-induced human hepatic stellate cells. METHODS: Human hepatic stellate cell line LX-2 was cultured in DMEM and stimulated by TGF-β1at the final concentration of 2.5, 5, 10 and 20 μg/L for 24 h or at final concentration of 10 μg/L for 12 h, 24 h and 48 h. LX-2 cells were pretreated with wortmannin, a specific inhibitor of PI3K/PKB signaling pathway, at final concentration of 0.1 μmol/L for 1 h, followed by incubation with TGF-β1at final concentration of 10 μg/L for 24 h. The cells were collected. The expression of OPN was detected by real-time PCR and Western blotting. RESULTS: In LX-2 cells, the expression of OPN was apparently elevated when incubated with TGF-β1. With the increase in TGF-β1concentration or the extension of incubation hours, the expression of OPN was increased gradually in a dose- and time-dependent manner with certain limits. LX-2 cells pretreated with wortmannin and incubated with TGF-β1had a significant decrease in the OPN expression as compared with control group (P<0.01). CONCLUSION: The expression of OPN in TGF-β1-induced LX-2 cells is regulated by the PI3K/PKB signaling pathway.

Osteopontin; Hepatic stellate cells; Transforming growth factor-β1; PI3K/PKB signaling pathway

1000- 4718(2015)01- 0093- 05

2014- 08- 06

2014- 10- 14

國家“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項(No. 2012ZX10005004-002； No. 2012ZX-10005010-002-003)；國家自然科學基金資助項目(No. 81102570； No. 81202662)；中國肝炎防治基金會王寶恩肝纖維化研究基金(No. CFHPC20131045； No. CFHPC20131046)；上海市教育委員會重點學科建設資助項目(No. J50307)

△通訊作者 張斌 Tel： 021-20256507； E-mail: zhangbsh@126.com； 高月求 Tel： 021-20256188； E-mail: gaoyueqiu@hotmail.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.018