香煙煙霧對C2C12小鼠成肌細胞HDAC2及炎癥介質的影響*

黃冬妹， 何志義， 麻芝英， 肖 影

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸內科，廣西 南寧 530021)

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香煙煙霧對C2C12小鼠成肌細胞HDAC2及炎癥介質的影響*

黃冬妹， 何志義△， 麻芝英， 肖 影

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸內科，廣西 南寧 530021)

目的： 探討香煙煙霧提取物(CSE)對C2C12小鼠成肌細胞組蛋白去乙?；?2(histone deacetylase 2, HDAC2)和炎癥介質的影響。方法: CSE刺激C2C12細胞，用質粒脂質體法將構建好的HDAC2 siRNA轉染細胞，實時熒光定量PCR和Western blotting法檢測HDAC2的表達情況，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清白細胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。結果: CSE組細胞HDAC2的mRNA及蛋白表達明顯低于對照組(P<0.05)，細胞上清IL-8和TNF-α的水平明顯高于對照組(P<0.05)；應用HDAC2 siRNA轉染細胞后再用CSE刺激細胞，細胞HDAC2的mRNA及蛋白表達均明顯低于CSE組及對照組(P<0.05)，細胞釋放IL-8和TNF-α的量均明顯高于CSE組及對照組(P<0.05)。結論: 氧化應激條件下C2C12小鼠成肌細胞通過下調HDAC2表達使IL-8和TNF-α表達增多。

氧化應激； 組蛋白去乙酰化酶2； 肌萎縮；慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)與氣道和肺組織對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常慢性炎癥反應有關[1]。骨骼肌萎縮是COPD常見的并存病，研究顯示COPD病人骨骼肌萎縮可能與肺部炎癥引起的全身性炎癥反應有關[1-4]。因此我們推測氧化應激一方面可以導致肺部炎癥，同時可以引發(fā)骨骼肌的炎癥，肺部炎癥和骨骼肌的炎癥具有一致性。目前有關氧化應激對肺部炎癥的研究較多，并認為組蛋白去乙?；?2(histone deacetylase 2，HDAC2)與核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)在氧化應激所致肺部慢性炎癥過程中起重要作用[5]。HDAC2和NF-κB是否也參與了骨骼肌慢性炎癥反應，并導致骨骼肌萎縮還有待進一步研究。我們前期研究顯示香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)能夠使C2C12細胞產(chǎn)生氧化應激，并能明顯上調炎癥轉錄因子NF-κB的活性，進而促進炎癥介質的釋放，炎癥負荷的增加抑制了骨骼肌的生長和分化[6]。因此，本研究進一步探討HDAC2是否也參與了氧化應激下骨骼肌炎癥反應。

材 料 和 方 法

1 細胞

小鼠C2C12成肌細胞株(購自中國科學院上海細胞所，由廣西醫(yī)科大學實驗中心保存)。

2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基和標準胎牛血清(Gibco)；Lipofectamine 2000脂質體和TRIzol試劑(Invitrogen)；MTT(Sigma)；IL-8和TNF-α ELISA 試劑盒(武漢華美公司)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa)；RIPA 蛋白裂解液(碧云天公司)；BCA 蛋白定量試劑盒和ECL發(fā)光底物(Pierce)；HRP標記的小鼠抗GAPDH單克隆抗體(上?？党晒?；小鼠抗HDAC2 抗體(Cell Signaling)，HRP標記的山羊抗小鼠IgG(中杉金橋公司)；所用引物由寶生物工程(大連)有限公司根據(jù)設計合成； 香煙為萬寶路牌，焦油量11 mg，煙堿量0.8 mg。

3 主要方法

3.1 C2C12細胞的培養(yǎng)與分化 小鼠成肌細胞株C2C12在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的高糖DMEM。每2～3 d傳代1次。傳代后C2C12細胞在含有10%馬血清的培養(yǎng)基下可分化成具有收縮功能的肌小管，分化為成熟肌細胞一般需6～7 d，分化好的細胞用于后續(xù)實驗。

3.2 香煙煙霧提取物制作 采用簡易冷凝裝置，依靠注射器驅動連續(xù)抽吸，將煙霧緩慢通入含有20 mL PBS的密閉玻璃容器中，并不斷振蕩使香煙煙霧充分溶解。抽吸完20支煙后收集液體，用紫外分光光度計在320 nm波長測得香煙提取物的濃度。MTT法確定CSE對細胞的合適作用濃度。

3.3 siRNA合成 根據(jù)HDAC2基因的信息，利用siRNA Designer System按照siRNA干擾片段的設計原則設計siRNA序列，送Life Technologies采用化學方法合成，前期實驗篩選出有效片段，正義鏈為5′-CCACAGCGAUGAGUAUAUCAAGUUU-3′，反義鏈為5′-AAACUUGAUAUACUCAUCGCUGUGG-3′。

3.4 細胞干預與分組 取對數(shù)生長期細胞，接種于24孔板，密度約為1×104cells/well，每組6個復孔。實驗分為4個組，分別為：(1)空白對照組：即分化成熟的小鼠成肌細胞組；(2)CSE組：CSE干預細胞24 h；(3)HDAC2 siRNA組：用脂質體Lipofectamine 2000瞬時轉染細胞；(4)HDAC2 siRNA+CSE組：先用脂質體Lipofectamine 2000瞬時轉染細胞，24 h后用CSE刺激細胞24 h。收集細胞提取RNA及蛋白進行分析，同時收集上清液測定IL-8和TNF-α水平。

3.5 Real-time PCR檢測HDAC2 mRNA在細胞中的表達 將上述細胞培養(yǎng)液吸去，每孔加入TRIzol提取總RNA，并逆轉錄成cDNA。使用Light Cycler實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增。HDAC2的上游引物為5’-AGCCCATGGCGTACAGTCAA-3’，下游引物為5’-GGGATGACCCTGGCCATAATAA-3’，擴增片段長度95 bp；GAPDH上游引物為5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’，下游引物為5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’，擴增片段長度150 bp。采用20 μL反應體系。反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算各組HDAC2 mRNA相對表達量。

3.6 Western blotting 法檢測HDAC2蛋白的表達 用移液管吸去各組培養(yǎng)基，各組細胞經(jīng)PBS洗滌3次后，用胰酶消化細胞，加入培養(yǎng)基終止消化并將細胞吹打下來。將消化下來的細胞懸液移至預冷的10 mL離心管，1 000 r/min，4 ℃離心10 min。棄上清，按RIPA裂解液說明書提取總蛋白，BCA試劑盒對提取的蛋白進行定量，取等量蛋白50 μg進行SDS-PAGE后轉移至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉封閉1 h后，分別以HRP標記的小鼠抗GAPDH單克隆抗體(1∶10 000)，小鼠抗HDAC2抗體(1∶1 000)冰上孵育過夜，HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)與膜室溫孵育1 h，GAPDH不孵育Ⅱ抗。暗室膠片曝光顯影、定影。Bio-Rad公司的全自動掃描儀掃描膠片，Quantity One 軟件分析結果。

3.7 各組細胞上清液IL-8和TNF-α的測定 收集各組細胞上清液，運用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的方法測定各組細胞上清液IL-8和TNF-α的水平，具體操作步驟按照試劑盒的說明書進行。

4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 MTT法確定不同濃度CSE對細胞活性的影響

CSE作用細胞24 h，0.1%和0.2%CSE對C2C12細胞生長無明顯影響(P>0.05)，濃度為0.4%時細胞生長活性明顯受抑制(P<0.05)。CSE作用細胞48 h，0.1%濃度的CSE對C2C12細胞生長無明顯影響(P>0.05)，濃度為0.2%和0.4%時細胞生長活性明顯受抑制(P<0.05)。CSE作用細胞72 h，0.1%、0.2%和0.4%濃度的CSE均明顯抑制細胞生長(P<0.05)，見表1。故本實驗以CSE合適終濃度0.2%作用細胞24 h進行干預。

表1 不同濃度CSE干預下C2C12細胞各時點的A值

*P<0.05vscontrol.

2 各組細胞HDAC2 mRNA 表達水平

CSE組、HDAC2 siRNA組和HDAC2 siRNA+CSE組HDAC2 mRNA表達水平均明顯低于對照組(P<0.05)，HDAC2 siRNA+CSE組HDAC2 mRNA表達水平明顯低于CSE組(P<0.05)，見圖1。

3 Western blotting法檢測各組細胞的HDAC2 蛋白表達

Western blotting 檢測結果顯示，CSE組、HDAC2 siRNA組以及HDAC2 siRNA+CSE的組HDAC2蛋白表達均低于對照組，HDAC2 siRNA+CSE組低于CSE組；用各組條帶的HDAC2灰度值比各組的GAPDH灰度值得到各組HDAC2蛋白相對表達量，CSE組、HDAC2 siRNA組以及HDAC2 siRNA+CSE組的HDAC2蛋白相對表達量均低于對照組，HDAC2 siRNA+CSE組低于CSE組(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The mRNA expression of HDAC2 in the C2C12 cells with different treatments. Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs control; *P<0.05 vs CSE.

Figure 2.The relative protein expression of HDAC2 in the C2C12 cells with different treatments. Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs control; *P<0.05 vs CSE.

4 各組細胞培養(yǎng)液炎癥介質表達水平

4.1 各組細胞釋放IL-8水平 CSE組和HDAC2 siRNA組細胞釋放IL-8的水平與對照組相比明顯增高(P<0.05)。siRNA沉默HDAC2基因后再用CSE刺激細胞，細胞釋放IL-8的水平與CSE組相比明顯升高(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The IL-8 level in the cell supernatant.Mean±SD. n= 3.#P<0.05 vs control; *P<0.05 vs CSE.

4.2 各組細胞釋放TNF-α水平 CSE組和HDAC2 siRNA組細胞釋放TNF-α的水平與對照組相比明顯增高(P<0.05)。siRNA沉默HDAC2基因后再用CSE刺激細胞，小鼠成肌細胞釋放TNF-α的水平與CSE組相比明顯升高(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The TNF-α level in the cell supernatant.Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs control; *P<0.05 vs CSE.

討 論

香煙以及其它有害顆粒導致的肺部異常炎癥反應不僅局限在肺部而且累及到全身多處器官，引起骨骼肌病變、心血管病變等，同時加重COPD疾病的進展[7-8]。骨骼肌是COPD系統(tǒng)性損傷最主要的受累器官，表現(xiàn)為肌肉萎縮和功能障礙[9]。研究顯示COPD病人骨骼肌萎縮與全身性炎癥反應密切相關[10-11]。目前認為COPD可能是一種全身炎癥反應綜合癥，香煙所導致的氧化應激使肺部產(chǎn)生異常過多的炎癥介質以及炎癥因子(IL-8、 TNF-α、MMP-9等)溢出到循環(huán)中產(chǎn)生的系統(tǒng)性炎癥可能是導致系統(tǒng)性病變及骨骼肌萎縮的直接原因[12-13]。

本實驗結果顯示，用CSE刺激小鼠成肌細胞C2C12，細胞HDAC2的表達減少，釋放IL-8和TNF-α的水平升高；而用HDAC2 siRNA沉默HDAC2基因后再用CSE刺激細胞，HDAC2的表達減少更加明顯，釋放IL-8和TNF-α的水平顯著升高。這表明CSE刺激小鼠成肌細胞C2C12可以下調HDAC2的表達，而沉默HDAC2基因后，CSE下調HDAC2的作用更為明顯，炎癥介質的釋放顯著增多。這與COPD肺部炎癥機制具有相似性，COPD病人骨骼肌炎癥可能是肺部炎癥溢出的結果。有研究顯示COPD病人肺組織和肺泡巨噬細胞HDAC2的活性和表達都下降，IL-8啟動子處的組蛋白乙酰化水平增高[5]。另外，大量研究表明在COPD肺部氧化應激引起的HDAC2下降使得組蛋白乙?；钚栽鰪姡M而引起DNA雙鏈打開，使得炎癥轉錄因子NF-κB等易與DNA結合，啟動炎癥基因轉錄過程，從而炎癥介質釋放增加[5]。本研究結果顯示HDAC2在CSE引起的小鼠成肌細胞炎癥反應中起到重要作用， HDAC2是否是通過NF-κB調控IL-8和TNF-α等炎癥介質的釋放還需進一步深入研究。

[1] Decramer M, Janssens W, Miravitlles M. Chronic obstructive pulmonary disease[J]. Lancet, 2012, 379(9823):1341-1351.

[2] Aryal S, Diaz-Guzman E, Mannino DM. Prevalence of COPD and comorbidity[J].Eur Respir Monogr，2013，59：1-12.

[3] Zeng M, Li Y, Jiang Y, et al. Local and systemic oxidative stress status in chronic obstructive pulmonary disease patients[J]. Can Respir J, 2013, 20(1):35-41.

[4] Hussain SN, Sandri M. Role of autophagy in COPD skeletal muscle dysfunction[J]. J Appl Physiol, 2013, 114(9):1273-1281.

[5] Barnes PJ. Role of HDAC2 in the pathophysiology of COPD[J]. Annu Rev Physiol, 2009, 71:451-464.

[6] 何志義, 梁 毅, 梁秋麗, 等. 香煙對小鼠C2C12成肌細胞分化的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2010,26(5):881-884.

[7] Adenuga D, Yao H, March TH, et al. Histone deacetylase 2 is phosphorylated, ubiquitinated, and degraded by cigarette smoke[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2009, 40(4):464-473.

[8] Nakamaru Y, Vuppusetty C, Wada H, et al. A protein deacetylase SIRT1 is a negative regulator of metalloproteinase-9[J]. FASEB J, 2009, 23(9):2810-2819.

[9] Gosker HR, Kubat B, Schaart G, et al. Myopathological features in skeletal muscle of patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Eur Respir J, 2003, 22(2):280-285.

[10]Glass DJ. Skeletal muscle hypertrophy and atrophy signaling pathways[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2005, 37(10):1974-1984.

[11]Spate U, Schulze PC. Proinflammatory cytokines and skeletal muscle[J]. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2004, 7(3):265-269.

[12]Adenuga D, Yao H, March TH, et al. Histone deacetylase 2 is phosphorylated, ubiquitinated, and degraded by cigarette smoke[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2009, 40(4):464-473.

[13]Barnes PJ, Celli BR. Systemic manifestations and comorbidities of COPD[J]. Eur Respir J, 2009, 33(5):1165-1185.

Effect of cigarette smoking condensate on HDAC2 and inflammatory mediators in mouse myoblast C2C12 cells

HUANG Dong-mei, HE Zhi-yi, MA Zhi-ying, XIAO Ying

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:zhiyi-river@163.com)

AIM: To investigate the effect of cigarette smoking condensate on histone deacetylase 2 (HDAC2) and inflammatory mediators in mouse myoblast C2C12 cells. METHODS: C2C12 cells were treated with cigarette smoke extract (CSE).HDAC2 siRNA was transfected into the cells using LipofectamineTM2000. The levels of interleukin-8 (IL-8) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the culture supernatants were measured by ELISA, and the expression of HDAC2 at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blotting. RESULTS: The expression of HDAC2 at mRNA and protein levels in CSE group was lower than that in control group (P<0.05). The supernatant levels of IL-8 and TNF-α in CSE group were significantly higher than those in control group (P<0.05). When the cells were transfected withHDAC2 siRNA followed by CSE stimulation, the expression of HDAC2 at mRNA and protein levels was decreased, and the supernatant levels of IL-8 and TNF-α were significantly increased as compared with CSE group and control group (P<0.05).CONCLUSION: Under the oxidative stress condition, C2C12 cells generate high levels of IL-8 and TNF-α by down-regulating the expression of HDAC2.

Oxidative stress; Histone deacetylase 2; Muscular atrophy; Chronic obstructive pulmonary disease

1000- 4718(2015)01- 0008- 04

2014- 09- 03

2014- 10- 14

國家自然科學基金資助項目(No.81260012； No.81160009)

△通訊作者 Tel： 0771-5356702； E-mail: zhiyi-river@163.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.002