miR-200a和miR-155在狼瘡性腎炎患者腎組織中的表達(dá)及其作用機(jī)制探討

潘嫵姍，何永成，陳洪滔

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東 廣州 510182；2.深圳市第二人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 深圳 518035）

miR-200a和miR-155在狼瘡性腎炎患者腎組織中的表達(dá)及其作用機(jī)制探討

潘嫵姍1，何永成2，陳洪滔2

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東 廣州 510182；2.深圳市第二人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 深圳 518035）

目的 探討miR-200a及miR-155在狼瘡性腎炎(LN)患者腎組織中的表達(dá)及其在LN發(fā)病機(jī)制中的作用。方法通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定30例LN患者和15例健康對(duì)照組腎組織中miR-200a及miR-155的表達(dá)水平。結(jié)果LN患者腎組織中miR-155的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，miR-200a的表達(dá)水平低于健康對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。LN患者腎組織中miR-200a的表達(dá)水平與狼瘡評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.391，P=0.032)，miR-200a的表達(dá)水平與尿蛋白呈負(fù)相關(guān)(r=-0.395，P=0.034)。miR-155與狼瘡評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.593，P=0.001)，miR-155表達(dá)水平與尿蛋白呈正相關(guān)(r=0.375，P=0.045)，miR-155的表達(dá)水平與eGFR呈負(fù)相關(guān)（r=-0.59，P=0.001）。miR-200a的表達(dá)水平與eGFR之間無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.22，P=0.242)。結(jié)論腎組織中miR-155和miR-200a在狼瘡性腎炎患者與健康對(duì)照組之間的表達(dá)水平有差異，且它們的表達(dá)水平與蛋白尿、腎功能及狼瘡評(píng)分均相關(guān)。提示LN患者組織中miR-200a與miR-155的表達(dá)與LN患者腎功能惡化和狼瘡疾病活動(dòng)程度密切相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)LN進(jìn)展的重要標(biāo)志物。

狼瘡性腎炎；miR-155；miR-200a

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種多系統(tǒng)自身免疫性疾病，它的特征是靶向核的自身抗體的產(chǎn)生引起了多器官的廣泛免疫病理?yè)p害。免疫復(fù)合物沉積在腎小球則導(dǎo)致狼瘡性腎炎(LN)的發(fā)生[1]。microRNAs (miRNAs)是一種內(nèi)源性、非編碼、單鏈長(zhǎng)度為18～24個(gè)核苷酸的小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[2]。多種miRNA在狼瘡性腎炎患者與健康對(duì)照組之間的表達(dá)存在差異[3]。有研究表明LN患者血清和尿液中的多種miRNAs水平與健康對(duì)照組相比存在差異。而另外一些研究證實(shí)，腎活檢組織中LN患者的miRNAs與健康對(duì)照組相比，一部分miRNAs表達(dá)下調(diào)而另外一部分miRNAs表達(dá)上調(diào)[4]。本研究應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)方法研究LN患者腎組織中miR-155及miR-200a的表達(dá)情況，尋找與LN相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)記物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年4月至2014年1月間在我院經(jīng)腎穿刺活檢診斷為L(zhǎng)N的患者30例。選取了被切除腎癌組織且沒(méi)有任何形態(tài)學(xué)證據(jù)表明存在腎臟疾病的15例健康腎組織作為對(duì)照。臨床資料包括血清補(bǔ)體水平、血清肌酐、尿蛋白、血清超敏C-反應(yīng)蛋白(hsCRP)等，腎穿刺活檢當(dāng)天的狼瘡活動(dòng)程度由系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分(SLEDAI)[5]來(lái)評(píng)估，腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)由MDRD方程評(píng)估。

1.2 主要試劑 miRSOL body fluid miRNA isolation kit(Cat.No.AB-MIS-001，AB-MIS-002)(深圳市盎然生物技術(shù)有限公司，中國(guó))；S-Poly(T)miRNA qPCR-assay(Cat.No.AB-MAS100001-AB-MAS86581) (深圳市盎然生物技術(shù)有限公司，中國(guó))。.

1.3 主要儀器 Real-time PCR儀(ABi7300)；低溫臺(tái)式離心機(jī)(Sigma公司，德國(guó))。

1.4 研究方法

1.4.1 miRNA提取 按miRSOL body fluid miRNA isolation kit說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行RNA提取。每個(gè)石蠟組織切除20 μm切片共10片置于EP管中，在放油石蠟組織的EP管中加入適量的RNAiso Plus后勻漿，室溫靜置5 min，12 000 r/min 4℃離心5 min，上清液移至新的1.5 ml EP管中。加入1/5 RNAiso Plus體積量的氯仿，蓋緊離心管蓋，劇烈振蕩20 s后室溫靜置5 min，之后12 000 r/min 4℃離心15 min。從離心機(jī)中小心取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層，無(wú)色的上清液含miRNA。吸取500 μl上清液轉(zhuǎn)移至另一新的1.5 ml離心管中，向上清液中加入等體積的異丙醇(500μl)，上下顛倒充分混勻，室溫靜置10 min后12 000 r/min 4℃離心10 min。棄去上清液，向沉淀中加入1 ml的75%乙醇，輕輕顛倒，清洗沉淀后12 000 r/min 4℃離心5 min，棄上清。最后沉淀室溫干燥2～3 min，加入10μ1 RNase-free水溶解，溶解產(chǎn)物置于-80℃儲(chǔ)存。

1.4.2 miRNA的逆轉(zhuǎn)錄 按照S-Poly(T)miRNAqPCR-assay試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將提取的miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按說(shuō)明書(shū)將miRNA10 μl加入反應(yīng)體系中。miR-200a和miR-155逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃保溫30 min，42℃保溫30 min，75℃加熱5 min，冰上放2 min。逆轉(zhuǎn)錄后可進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。

1.4.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 按S-Poly(T)miRNA qPCR-assay試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。整個(gè)反應(yīng)體系20 μl，cDNA稀釋5倍，10× selfTaqBuffer 2 μl，2 mmol/L、dNTP mix 2 μl，SelfTaqPolymerase 0.5 μl，10μmol/L正向引物0.4 μl，10μmol/L反向引物(5 862)0.4μl，10μmol/L探針0.5 μl，ROX Reference Dye(100X，Sigma)0.2μl，稀釋cDNA 8 μl，6μl，每一個(gè)miRNA做2次。反應(yīng)條件：95℃30 s 1個(gè)循環(huán)；95℃10 s，60°C 30 s 40個(gè)循環(huán)。在Real-time PCR儀(ABi7300)上進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析 以外源snor44為內(nèi)參，表達(dá)量以2^-ΔCt表示，其中ΔCt=AVG(檢測(cè)的miRNA)-AVG(內(nèi)參基因)；采用副孔檢測(cè)，AVG為檢測(cè)miR-200a及miR-155CT值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。服從正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。不服從正態(tài)分布定量資料以中位數(shù)和極值表示，兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)。指標(biāo)間量變關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)及臨床資料比較 本組30例LN患者中男女比例為1:29；平均年齡(30.57±10.82)歲，GFR為(97.66±40.29)ml/(min·1.73 m2)，24 h尿蛋白定量(2.54±2.48)g，C3水平(0.55±0.26)g/L，C4水平(0.06±0.03)g/L，C反應(yīng)蛋白(5.09±5.03)mg/L，狼瘡評(píng)分為(15.47±4.86)分。30例LN患者中，3例組織學(xué)診斷為系膜增生型(Ⅱ型)，2例為局灶節(jié)段型(Ⅲ型)，20例為彌漫增生型(Ⅳ型)，2例為(Ⅳ+Ⅴ型)，3例為膜型(Ⅴ型)。

2.2 LN患者與健康對(duì)照組腎組織中miRNA的表達(dá)水平比較 LN患者腎組織中miR-155的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，miR-200a的表達(dá)水平低于健康對(duì)照組，且差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)圖1。

2.3 LN患者腎組織中miRNA表達(dá)與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性 腎組織中miR-155(r=-0.59，P=0.001)與eGFR呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。miR-200a(r=0.22，P=0.242)的表達(dá)水平與eGFR無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)，見(jiàn)圖2。腎組織中miR-155(r= 0.593，P=0.001)表達(dá)水平與狼瘡評(píng)分呈正相關(guān)，miR-200a(r=-0.391，P=0.032)的表達(dá)水平與狼瘡評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。腎組織中miR-155(r=0.375，P=0.045)表達(dá)水平與尿蛋白呈正相關(guān)，miR-200a(r=-0.395，P=0.034)的表達(dá)水平與尿蛋白呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

圖1 LN患者與健康對(duì)照組腎組織中miRNA的表達(dá)

圖2 LN患者腎組織miRNA水平與GFR之間的相關(guān)性

圖3 LN患者腎組織miRNA水平與狼瘡評(píng)分之間的相關(guān)性

圖4 LN患者腎組織miRNA水平與尿蛋白之間的相關(guān)性

3 討論

最近的一些研究證實(shí)，miRNAs能夠在各種來(lái)源，例如組織，血清和其他體液中被檢測(cè)到。miRNAs在各種惡性和非惡性疾病，包括癌癥，炎癥和自身免疫性疾病中的作用是顯而易見(jiàn)的，并且有越來(lái)越多的證據(jù)證明miRNA在SLE及LN中也發(fā)揮了重要作用[6]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)腎組織中miR-155及miR-200a的表達(dá)水平在LN患者和正常對(duì)照組之間存在差異，并且，miRNA表達(dá)水平的改變與臨床疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。結(jié)果表明，這些miRNA的表達(dá)可能在LN的發(fā)病機(jī)制中起一定作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，相比健康對(duì)照者或非活動(dòng)性SLE患者，活動(dòng)性SLE患者循環(huán)中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在其他CD4+T細(xì)胞中的比例下降得到了證實(shí)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞缺陷也被證明了與疾病的嚴(yán)重度相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)比非自身免疫性小鼠，MRL/lpr小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中的miR-155有所上調(diào)[7]。miR-155和miR-155*可以共同調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素在漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞的產(chǎn)生，為狼瘡性腎炎的發(fā)病提供了潛在依據(jù)[8]。Te等[9]發(fā)現(xiàn)血清miR-155的表達(dá)水平在SLE患者中比健康對(duì)照組降低，而在非裔美國(guó)人外周血單個(gè)核細(xì)胞中它的表達(dá)水平上調(diào)。Wang等[10]測(cè)定了40例LN患者尿液沉渣中的miR-155水平并與13名健康對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)LN患者尿液沉渣中miR-155的表達(dá)水平顯著升高，且與蛋白尿程度及狼瘡評(píng)分呈正相關(guān)。

腎臟損害是系統(tǒng)性紅斑狼瘡最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，有相當(dāng)一部分的患者伴隨有蛋白尿和腎功能異常。在LN腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程中，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)發(fā)揮著重要的作用[11]。研究表明E-box抑制因子1(ZEB1)和E-box抑制因子2(ZEB2)能與上皮細(xì)胞內(nèi)的E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)基因的啟動(dòng)子序列中的E-box(CACCTC/G)序列結(jié)合而抑制其轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生[12]。Wang等[13]測(cè)定40例LN患者血清和尿液中的miRNAs水平并與健康對(duì)照組相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清與尿液中的miR-200家族(比如miR-200a、miR-141)、miR-205和miR-192，可以抑制ZEB1或ZEB2的表達(dá)。這些miRNA在LN患者血清中的表達(dá)下調(diào)，而miR-200家族、miR-192在LN患者尿液中的水平下調(diào)。血清中的miR-200a與蛋白尿程度呈負(fù)相關(guān)，并且與狼瘡評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，組織中miR-155的表達(dá)水平在狼瘡性腎炎患者中高于健康對(duì)照組，并且它的表達(dá)水平與eGFR呈負(fù)相關(guān)，與尿蛋白及狼瘡評(píng)分呈正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-200a腎組織中的表達(dá)水平在狼瘡性腎炎患者中低于健康對(duì)照組，miR-200a的表達(dá)水平與尿蛋白及狼瘡評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與eGFR之間無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系?？偟膩?lái)說(shuō)，我們的研究結(jié)果提示LN患者腎組織中miR-200a、miR-155表達(dá)水平的差異與LN患者腎功能惡化和狼瘡疾病活動(dòng)程度密切相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)LN進(jìn)展的重要標(biāo)志物。

本研究有自身的局限性。第一，由于標(biāo)本量較小，我們沒(méi)有足夠的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行狼瘡性腎炎組織學(xué)分型之間的比較，需要較大樣本來(lái)做進(jìn)一步研究。第二、本研究是單中心橫斷面研究，未對(duì)同一患者治療前后做重復(fù)腎穿刺活檢，從而對(duì)療效進(jìn)行前瞻性研究，還需要搜集更多臨床數(shù)據(jù)做進(jìn)一步研究。

綜上所述，LN患者腎組織中miR-155的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，且其表達(dá)水平與eGFR呈負(fù)相關(guān)，與尿蛋白及狼瘡評(píng)分呈正相關(guān)。LN患者腎組織中miR-200a的表達(dá)水平低于健康對(duì)照組，miR-200a的表達(dá)水平與尿蛋白及狼瘡評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。腎組織中miR-200a、miR-155表達(dá)水平的差異與LN患者腎功能惡化和狼瘡疾病活動(dòng)程度密切相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)LN進(jìn)展的重要標(biāo)志物。

[1]Wakeland EK,Liu K,Graham RR,et al.Delineating the genetic basis of systemic lupus erythematosus[J].Immunity,2001,15:397-408.

[2]Filipowicz W,Bhattacharyya SN,Sonenberg N,et al.Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs:are the answers in sight?[J]Nat Rev Genet,2008,9:102-114.

[3]Dai Y,Sui W,Lan H,et al.Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in renal biopsies of lupus nephritis patients[J]. Rheumatol Int,2009,29:749-754.

[4]Miao CG,Yang YY,He X,et al.The emerging role of microRNAs in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus[J].Cell Signal,2013,25(9):1828-1836.

[5]Bombardier C,Gladman D,Urowitz M,et al.Derivation of the SLEDAI.A disease activity index for lupus patients.The Committee on Prognosis Studies in SLE[J].Arthritis Rheum,1992,35:630-640.

[6]Du T,Zamore PD.microPrimer:the biogenesis and function of microRNA[J].Development,2005,132:4645-4652.

[7]Divekar AA,Dubey S,Gangalum PR,et al.Dicer insufficiency and microRNA-155 overexpression in lupus regulatory T cells:an apparent paradox in the setting of an inflammatory[J].Milieu Immunol,2011,186:924-930.

[8]Yao R,Ma Y,Du Y,et al.The altered expression of inflammation-related microRNAs with microRNA 155 expression correlates with Th17 differentiation in patients with acute coronary syndrome[J]. Cell Mol Immunol,2011,8:486-495.

[9]Te JL,Dozmorov IM,Guthridge JM,et al.Identification of unique microRNA signature associated with lupus nephritis[J],PLoS One, 2010,11:e10344.

[10]Wang G,Tam LS,Kwan BC,et al.Expression of miR-146a and miR-155 in the urinary sediment of systemic lupus erythematosus [J].Clin Rheumatol,2012,31:435-440.

[11]Liu Y.Epithelial to mesenchymal transition in renal fibrogenesis: Pathologic significance molecular mechanism and therapeutic intervention[J].JAm Soc Nephrol,2004,15:1-12.

[12]Naganuma S,Ohashi S,Kimura S,et al.ZEB1 and ZEB2 promote EMT and invasion in esophageal squamous cell carcinoma[J].Cancer Res,2010,70(8 Suppl 1):2293.

[13]Wang G,Tam LS,Li KM,et al.Serum and urinary free microRNA level in patients with systemic lupus erythematosus[J].Lupus, 2011,20(5):493-500.

Expression of miR-200a and miR-155 in renal tissue of patients with lupus nephritis and its mechanisms.

PAN Wu-shan1,HE Yong-cheng2,CHEN Hong-tao2.1.Graduate School,Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182,Guangdong,CHINA;2.Department of Nephrology,Shenzhen Second People's Hospital,Shenzhen 518035, Guangdong,CHINA

Objective To investigate the expression of miR-200a and miR-155 in the renal tissue of patients with lupus nephritis(LN),and to analyze its role in the pathogenesis of LN.MethodsWe quantified the expression level of miR-200a and miR-155 in the renal tissue of 30 patients with LN and 15 healthy controls through real-time PCR.ResultsCompared with health controls,the miR-155 level in LN patients was higher,and miR-200a level in LN patients was lower,with statistically significant difference(P＜0.001).miR-200a expression was negatively correlated with proteinuria(r=-0.395,P=0.034)and SLEDA(r=-0.391,P=0.032).miR-155 expression was positively correlated with proteinuria(r=0.375,P=0.045)and SLEDA(r=0.593,P=0.001),while miR-155 expression was nagatively correlated with estimated GFR(r=-0.5,P=0.001).miR-200a expression showed no significant correlation with estimated GFR (r=0.22,P=0.242).ConclusionThe miR-155 and miR-200a are differentially expressed in the renal tissue of LN patients and normal controls,and their expressions are closely related to the proteinuria,renal function and SLEDA.miR-155 and miR-200a expression in renal tissue are closely related to the degree of deterioration of renal function and lupus disease activity,which can serve as important targets in the pathogenesis of lupus nephritis.

Lupus nephritis;miR-155;miR-200a

R593.24+2

A

1003—6350（2015）10—1423—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.10.0509

2014-05-08)

何永成。E-mail：heyongcheng@medmail.com.cn