結(jié)腸癌患者血清miRNA表達(dá)譜分析

榮 維，宋麗芳，朱 旭，宋麗萍

（1.撫順市礦務(wù)局總醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 撫順 113008；2.撫順市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 撫順 113008；3.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所病源室，北京 100101）

結(jié)腸癌患者血清miRNA表達(dá)譜分析

榮 維1，宋麗芳2，朱 旭2，宋麗萍3

（1.撫順市礦務(wù)局總醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 撫順 113008；2.撫順市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 撫順 113008；3.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所病源室，北京 100101）

目的 探討結(jié)腸癌患者血清中miRNA分子的表達(dá)差異，尋找潛在的結(jié)腸癌診斷分子標(biāo)記物。方法以12例正常人血清樣本為對(duì)照組，采用miRNA芯片技術(shù)對(duì)12例結(jié)腸癌患者血清樣本的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析；隨后，擴(kuò)大患者樣本量至40例，擴(kuò)大對(duì)照組樣本量至45例，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)對(duì)差異表達(dá)的miRNA分子進(jìn)行驗(yàn)證分析。結(jié)果芯片結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，結(jié)腸癌患者血清miRNA表達(dá)譜發(fā)生了顯著的變化，其中3條miRNA表達(dá)水平上調(diào)，21條miRNA表達(dá)水平下調(diào)；Real-time PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，結(jié)腸癌患者血清中miR-508和miR-502-5p的表達(dá)水平明顯下調(diào)。結(jié)論miR-508和miR-502-5p可作為結(jié)腸癌診斷的潛在分子標(biāo)記物進(jìn)行開(kāi)發(fā)。

結(jié)腸癌；血清；miRNA；芯片；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤之一。目前結(jié)腸癌臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)方法為電子結(jié)腸鏡診斷技術(shù)，該技術(shù)需要一定的設(shè)備和技術(shù)支持，對(duì)操作者的操作熟練程度要求較高,診斷時(shí)需要侵入人體檢查，并且有發(fā)生出血及穿孔的并發(fā)癥危險(xiǎn)，因此有必要研發(fā)一些新型診斷方法以減輕患者的痛苦和降低診斷的風(fēng)險(xiǎn)[1]。

microRNA(miRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，長(zhǎng)度為18～22 nt，通過(guò)靶向結(jié)合mRNA分子的3'UTR端來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控[2-11]。近年來(lái)，很多學(xué)者已經(jīng)證實(shí)腫瘤組織中的miRNA分子可作為新型標(biāo)志物應(yīng)用于腫瘤臨床診斷[12-17]。有研究表明，miRNA可以在血清中穩(wěn)定存在，因此循環(huán)miRNA作為新穎的生物標(biāo)志物受到了廣泛的關(guān)注，并且其可作為疾病診斷標(biāo)志物的潛力已得到認(rèn)可。

本研究以正常人的血清樣本為對(duì)照，利用miRNA芯片篩選技術(shù)對(duì)比分析了結(jié)腸癌患者血清中miRNA表達(dá)譜變化；隨后，擴(kuò)大結(jié)腸癌患者樣本量至40例，對(duì)照組樣本量至45例，應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)并對(duì)芯片的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，最終篩選獲得了兩個(gè)在結(jié)腸癌患者血清中特異性低表達(dá)的miRNA分子。本研究結(jié)果為結(jié)腸癌診斷提供了新型潛在分子標(biāo)記物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1～12月12例結(jié)腸癌患者[年齡平均(62.2±8.6)歲，男性、女性各6例]血清作為研究對(duì)象(結(jié)腸癌組)。所有研究對(duì)象均為術(shù)后病理診斷為未發(fā)生轉(zhuǎn)移的原位結(jié)腸癌患者，在采集樣本前均未接受過(guò)化療藥物治療以及切除術(shù)處理。另收集12例健康人[年齡平均(60.2±6.4)歲，男性、女性各6例]血清作為對(duì)照組。本研究獲得撫順市中心醫(yī)院以及撫順市礦務(wù)局總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有組織標(biāo)本的收集均征得患者本人的知情同意。

1.2 血漿樣本收集 采集受試者靜脈血4 ml于EDTA抗凝管中，輕輕顛倒數(shù)次后靜置10 min，于室溫2 500 r/min離心15 min，分兩層，吸取上層血漿400μl轉(zhuǎn)移至一個(gè)EP(RNase free)管中，-70℃保存。

1.3 血漿總RNA提取 將保存的血漿置于冰上溶解，4℃，12 000 r/min離心5 min，吸取上層血漿300μl轉(zhuǎn)移至一個(gè)EP(RNase free)管中，用Ambion mir VanaTMPARISTM提取試劑盒按說(shuō)明書(shū)提取。

1.4 miRNA芯片分析 將患者組和對(duì)照組的樣本按照1.3中的方法提取RNA分子。將提取獲得的RNA分子送到ABI(Applied Biosystems by Life Technologies)公司進(jìn)行miRNA芯片分析。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)miRNA的表達(dá) 分別按照1.3中的方法提取患者組和對(duì)照組血漿樣本的RNA分子，使用miRcute miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA分子，使用miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(天根生化科技有限公司)定量檢測(cè)樣本中miRNA分子的表達(dá)，使用U6分子作為檢測(cè)內(nèi)參。

1.6 結(jié)腸癌血漿中miRNA分子標(biāo)志物的驗(yàn)證 為了篩選血漿中miRNA分子的標(biāo)志物，2013年 1～12月我們擴(kuò)大收集了40例結(jié)腸癌患者[年齡平均(61.4±10.27)歲，男22例，女18例]的血清樣本，所有研究對(duì)象均為術(shù)后病理診斷為未發(fā)生轉(zhuǎn)移的原位結(jié)腸癌患者，結(jié)腸癌患者在采集樣本前均未接受過(guò)化療藥物治療以及切除術(shù)處理。另收集45例健康對(duì)照者[年齡平均(62.2±12.01)歲，男24名，女21名]血漿樣本作為對(duì)照組進(jìn)行獨(dú)立樣本的驗(yàn)證。本研究獲得撫順市中心醫(yī)院以及撫順市礦務(wù)局總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有組織標(biāo)本的收集均征得患者本人的知情同意。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 miRNA芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照Ratio≥1.4或≤0.7倍為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出患者組和對(duì)照組之間差異；臨床特征與分組間的關(guān)系用Mann-Whituey U和Student's-t-test分析；以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芯片分析結(jié)腸癌患者血清中miRNA表達(dá)譜變化 利用miRNA芯片分析結(jié)腸癌患者混合血清中miRNA表達(dá)譜的變化，以U6表達(dá)水平作為檢測(cè)內(nèi)參。以Ratio≥1.4或≤0.7倍為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出發(fā)生變化的miRNA分子。結(jié)果如表1所示，其中表達(dá)上調(diào)的miRNA分子有3個(gè)，表達(dá)下調(diào)的miRNA分子有21個(gè)。

表1 結(jié)腸癌患者血清中miRNA表達(dá)的變化

2.2 Real-time PCR驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果 為了進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果，篩選出結(jié)腸癌血漿中miRNA分子標(biāo)志物群，我們將結(jié)腸癌患者樣本量擴(kuò)大至40例(未轉(zhuǎn)移原位結(jié)腸癌，未經(jīng)過(guò)手術(shù)和接受過(guò)化療)，對(duì)照樣本量擴(kuò)大至45例。利用Real-time PCR技術(shù)對(duì)所有樣本中上述24條miRNA分子進(jìn)行獨(dú)立樣本檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示，在結(jié)腸癌患者血漿中miR-508 (Mann-WhitneyU=7.28，P=0.028)和 miR-502-5p (Mann-Whitney U=8.65，P=0.035)的表達(dá)水平較正常對(duì)照組均有顯著降低(P＜0.05)。

圖1 血漿中miRNA在結(jié)腸癌組與正常組的相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

在本研究中，為了篩選獲得的結(jié)腸癌患者血漿中miRNA分子標(biāo)志物群，筆者2013年1～12月共收集了12例結(jié)腸癌血漿樣本(患者未接受化療和手術(shù)處理)進(jìn)行miRNA表達(dá)譜的分析，以12例正常人血漿作為對(duì)照組，并以U6的表達(dá)水平作為內(nèi)參。研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌患者血漿中共有24條miRNA分子的表達(dá)水平發(fā)生了顯著性變化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA芯片的篩選結(jié)果，我們擴(kuò)大了樣本收集量，將結(jié)腸癌患者樣本擴(kuò)大至40例，對(duì)照組樣本擴(kuò)大至45例。用Real-time PCR技術(shù)驗(yàn)證篩選獲得的24個(gè)miRNA分子在獨(dú)立樣本中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在結(jié)腸癌患者血漿中miR-508和miR-502-5p這兩條miRNA分子的表達(dá)水平較對(duì)照組有顯著下降(P＜0.05)。

眾所周知，結(jié)腸癌的早期診斷對(duì)于患者的存活率有較大影響[18-20]。因此，本研究會(huì)繼續(xù)擴(kuò)大收集樣本量，深入分析miR-508和miR-502-5p在不同時(shí)期，特別是早期的結(jié)腸癌患者血清中的表達(dá)水平，進(jìn)一步探討miR-508和miR-502-5p作為潛在結(jié)腸癌診斷分子標(biāo)記物的可能性。

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Analysis of miRNA profile in serum of patients with colon cancer.

RONG Wei1,SONG Li-fang2,ZHU Xu2,SONG Li-ping3.
1.Department of Gastroenterology,Fushun Mining Bureau General Hospital,Fushun 113008,Liaoning, CHINA;2.Department of Gastroenterology,the Central Hospital of Fushun,Fushun 113008,Liaoning,CHINA;3. Department of Pathogen,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Science,Beijing 100101,CHINA

ObjectiveTo profile the miRNA expression pattern in the serum of patients with colon cancer, and to explore the potential molecular marker for the diagnosis of colon cancer.MethodsThe 12 serum samples of colon cancer patients were collected and miRNA chips were used to analyze the miRNA profile of colon cancer(the study group).The 12 serum samples of normal persons were collected as control(the control group).And then the samples of colon cancer and control were extended to 40 cases and 45 cases respectively.Real-time PCR was used to further validate the expression level of miRNA in samples of colon cancer.ResultsCompared to the control group,the miRNA profile of the study group represented obvious changes,with 3 miRNAs up-regulated and 21 miRNAs down-regulated.The results of real-time PCR showed that the expression levels of miR-508 and miR-502-5p were down-regulated significantly in the study group compared to the control group.ConclusionmiR-508 and miR-502-5p can be explored as potential diagnosis marker for colon cancer.

Colon cancer;Serum;miRNA;Chip;Real-time PCR

R735.3+5

A

1003—6350（2015）06—0841—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0300

2014-09-18)

宋麗芳。E-mail：slp_0705@sina.com