α-硫辛酸對慢性腦低灌注大鼠腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和單胺氧化酶的影響

趙冉冉，徐曉臣，王 玲，路志民，張文忠，劉吉祥

(邯鄲市第一醫(yī)院急診科1、神經(jīng)內(nèi)科2、泌尿科3、神經(jīng)外科4，河北 邯鄲 056002)

α-硫辛酸對慢性腦低灌注大鼠腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和單胺氧化酶的影響

趙冉冉1，徐曉臣2，王 玲1，路志民3，張文忠1，劉吉祥4

(邯鄲市第一醫(yī)院急診科1、神經(jīng)內(nèi)科2、泌尿科3、神經(jīng)外科4，河北 邯鄲 056002)

目的 觀察α-硫辛酸(ALA)對慢性腦低灌注(CCH)血管性癡呆大鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和單胺氧化酶的影響。方法健康成年雄性Wistar大鼠60只隨機(jī)分為假手術(shù)組(SHAM組)、慢性腦低灌注組(CCH組)、低劑量治療組(L-ALA組，50 mg/kg)和高劑量治療組(H-ALA組，100 mg/kg)，每組15只。利用雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)制備慢性腦低灌注模型，SHAM組手術(shù)步驟與CCH組相同但不結(jié)扎頸總動(dòng)脈。從實(shí)驗(yàn)第29天起Morris水迷宮檢測動(dòng)物認(rèn)知功能，水迷宮結(jié)束后取材，采用高效液相色譜儀檢測去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)在大鼠前腦皮層的水平，分光光度計(jì)檢測前腦皮層單胺氧化酶(MAO)的水平。結(jié)果與SHAM組比較，CCH組大鼠前腦皮層NE、DA和5-HT的含量均顯著下降，MAO含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與CCH組比較，低劑量ALA和高劑量ALA治療均能顯著提高CCH大鼠前腦皮層組織的NE、DA和5-HT含量，降低MAO水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論α-硫辛酸能夠明顯改善CCH大鼠的行為學(xué)異常，調(diào)節(jié)CCH大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)。

慢性腦低灌注；α-硫辛酸；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)；單胺氧化酶

血管性認(rèn)知功能障礙(Vascular cognitive impairment，VCI)是指由各種心、腦血管病而引起的獲得性學(xué)習(xí)、記憶功能下降。隨著社會人口逐漸老齡化，心腦血管病發(fā)病率明顯增加，同時(shí)，醫(yī)療水平的進(jìn)步使得心腦血管疾病生存率提高，VCI的發(fā)病呈快速增長的趨勢，造成生活質(zhì)量的下降，嚴(yán)重威脅人類身心健康[1]。然而，血管性認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前尚無有效改善血管性認(rèn)知功能障礙的方法，臨床急切需要治療VCI的特效藥物。本研究通過雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎制備慢性腦低灌注血管性認(rèn)知功能障礙大鼠模型，觀察并探討α-硫辛酸對血管性認(rèn)知功能障礙大鼠行為學(xué)和腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、單胺氧化酶的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和模型制備 健康成年雄性Wistar大鼠共60只，體質(zhì)量(260±20)g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(SHAM組)、慢性腦低灌注組(CCH組)、低劑量治療組(L-ALA組，50 mg/kg)和高劑量治療組(H-ALA組，100 mg/kg)，每組15只；麻醉采用10%的水合氯醛腹腔注射方式，在動(dòng)物麻醉后仰臥位固定，頸前區(qū)消毒，沿頸前正中做縱行的切口，逐層切開皮膚、皮下組織，然后小心地鈍性分離出雙側(cè)的頸總動(dòng)脈，避免刺激頸動(dòng)脈竇，隨后用絲線依次結(jié)扎住雙側(cè)頸總動(dòng)脈的近心端和遠(yuǎn)心端，在兩個(gè)結(jié)扎點(diǎn)間將動(dòng)脈剪斷，縫合皮膚。術(shù)畢將動(dòng)物放回籠中。密切觀察大鼠精神狀態(tài)、飲食等一般情況。在手術(shù)過程中假手術(shù)組大鼠僅僅是分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，而不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，其他步驟不變。術(shù)后24 h起，SHAM組和CCH組每日腹腔注射生理鹽水，L-ALA組和H-ALA組給予相應(yīng)的ALA腹腔注射，每日一次，共28 d。

1.2 主要藥品和試劑α-硫辛酸由Sigma公司提供，去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)標(biāo)準(zhǔn)品均由中國生物藥品制品檢定所提供，MAO檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 Morris水迷宮試驗(yàn) 自術(shù)后第29天起進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)，來評價(jià)各組大鼠的認(rèn)知功能。其中，第29～33天動(dòng)物進(jìn)行定向航行試驗(yàn)，試驗(yàn)具體內(nèi)容是將動(dòng)物分別從四個(gè)象限入水，大鼠從入水到爬上平臺所花費(fèi)的時(shí)間記錄為逃避潛伏期，取4次逃避潛伏期的均值為當(dāng)日的逃避潛伏期并進(jìn)行分析；第34天動(dòng)物進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，水迷宮中的平臺撤除后將大鼠從固定的一個(gè)象限入水，觀察大鼠入水后2 min里在平臺所在象限的游泳時(shí)間。

1.4 NE、DA、5-HT檢測 Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后各組動(dòng)物采用斷頭取腦的方法取材，冰盤上快速分離前腦皮層組織并稱濕重后，按1：10(mg：μl)比例與預(yù)冷的高氯酸混合，隨后在冰浴中制備為10%的腦皮層組織勻漿，離心并取上清液進(jìn)行下一步的檢驗(yàn)，采用液相高效色譜儀分析各指標(biāo)含量。

1.5 單胺氧化酶(MAO)檢測 Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后采用大鼠斷頭取腦的方法取材，冰盤上快速分離出前腦皮層組織，稱濕重后加冰生理鹽水制備成10%勻漿，按照試劑盒說明書進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)步驟。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件對本研究中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析用于水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期的數(shù)據(jù)分析，其他數(shù)據(jù)采用one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用LSD，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮結(jié)果 與SHAM組比較，CCH組大鼠在定向航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期顯著延長，與CCH組比較，α-硫辛酸治療的兩組動(dòng)物，L-ALA組和H-ALA組大鼠在定向航行實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期均明顯縮短(P＜0.05)；空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SHAM組比較，CCH組大鼠目標(biāo)象限的游泳時(shí)間顯著縮短，L-ALA組和H-ALA組與CCH組相比在目標(biāo)象限的游泳時(shí)間顯著增加(P＜0.01)；在逃避潛伏期和目標(biāo)象限游泳時(shí)間兩個(gè)指標(biāo)上，高劑量ALA的改善作用更好。在各組大鼠間游泳速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 α-硫辛酸對Morris水迷宮表現(xiàn)的影響

2.2α-硫辛酸對腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和MAO的影響 與SHAM組比較，CCH組大鼠前腦皮層內(nèi)NE、DA和5-HT水平均明顯下降(P＜0.05)，MAO的水平明顯升高(P＜0.05)；低劑量和高劑量α-硫辛酸治療均能明顯緩解腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，表現(xiàn)為明顯升高了血管性認(rèn)知功能障礙大鼠前腦皮層中NE、DA和5-HT水平(P＜0.05)，顯著降低了MAO水平(P＜0.05)；L-ALA組NE、DA、5-HT和MAO仍未達(dá)到SHAM組的正常水平，H-ALA組各項(xiàng)指標(biāo)水平與SHAM組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 α-硫辛酸對前腦皮層NE、DA、5-HT和MAO含量的影響(±s)

表2 α-硫辛酸對前腦皮層NE、DA、5-HT和MAO含量的影響(±s)

注：a與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b與CCH組比較，P＜0.05。

組別SHAM組CCH組L-ALA組H-ALA組F值P值NE (ng/g) 268.1±21.9 176.9±11.2a211.6±19.1ab259.4±22.3b29.007 0.001 DA (ng/g) 533.1.±52.8 298.7±21.1a402.3±38.7ab519.9±48.7b49.281 0.001 5-HT (ng/g) 468.9±41.3 299.3±19.1a349.9±32.5ab450.5±41.8b39.783 0.001 MAO [U/(h·mg·prot)] 16.98±1.34 30.73±2.57a22.68±2.19ab17.84±1.25b3.338 0.001

3 討論

慢性腦低灌注(Chronic cerebral hypoperfusion，CCH)是血管性認(rèn)知功能障礙和阿爾茨海默病中常見的病理狀態(tài)[1]，CCH可由高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、吸煙等因素誘發(fā)。CCH與腦血管功能狀態(tài)密切相關(guān)，是導(dǎo)致血管性癡呆(VD)的主要原因[2]。臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均表明，CCH可導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷[3-4]。存在有CCH的患者常出現(xiàn)不同程度的認(rèn)知功能障礙。由于CCH在癡呆中的重要作用，CCH已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)研究的前沿和熱點(diǎn)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，CCH可通過氧化應(yīng)激、神經(jīng)遞質(zhì)紊亂和促炎因子的釋放等機(jī)制導(dǎo)致神經(jīng)退行性改變，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損害和白質(zhì)的損害[5-6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后腦組織中脂質(zhì)過氧化和氧化性DNA損傷均明顯增加[7]，因此抗氧化治療有可能是治療血管性認(rèn)知功能障礙的有效策略。

學(xué)習(xí)和記憶功能的下降是血管性認(rèn)知功能障礙患者的主要臨床表現(xiàn)。從發(fā)病機(jī)制上看，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，除了膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)與認(rèn)知聯(lián)系密切外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在學(xué)習(xí)和記憶過程中發(fā)揮了重要的易化作用，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)正常的合成及釋放是學(xué)習(xí)和記憶功能的生化基礎(chǔ)。有研究報(bào)道，在血管性認(rèn)知功能障礙的患者中發(fā)現(xiàn)，中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的下降與認(rèn)知功能的下降密切相關(guān)，上調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量可能具有增強(qiáng)認(rèn)知功能的作用。與此同時(shí)，腦內(nèi)5-HT含量的下降也是血管性認(rèn)知功能受損的典型表現(xiàn)[8]，5-HT再攝取抑制劑能有效增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶功能[9]。

作為迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一同時(shí)具有水溶性和脂溶性的強(qiáng)效抗氧化劑，α-硫辛酸能夠順利通過血腦屏障從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。α-硫辛酸可通過以下機(jī)制減輕機(jī)體的氧化應(yīng)激：直接清除活性氧自由基、與金屬離子螯合進(jìn)而減少活性氧自由基、使體內(nèi)的內(nèi)生性抗氧化物再生成并循環(huán)利用從而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御、通過在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為還原型二氫硫辛酸而顯著增強(qiáng)自身抗氧化能力。既往的研究表明，α-硫辛酸對糖尿病及其并發(fā)癥[10]、腦外傷[11]、阿爾茨海默病[12]、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎[13]等都有顯著的保護(hù)作用。作為能夠改善認(rèn)知功能的強(qiáng)抗氧化劑，α-硫辛酸是否在血管性認(rèn)知功能障礙中也具有治療作用，正是本研究所要探討的問題。

本研究發(fā)現(xiàn)，CCH大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力明顯下降，α-硫辛酸治療4周后CCH大鼠認(rèn)知功能得以明顯改善，且改善作用與劑量相關(guān)；檢測大鼠前腦皮層中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)，CCH大鼠前腦皮層中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、NE和5-HT的含量均明顯下降，MAO的含量顯著升高，而α-硫辛酸治療4周后可明顯改善單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的紊亂。表明ALA對血管性認(rèn)知功能障礙大鼠有明顯的治療作用，同時(shí)ALA能夠調(diào)節(jié)腦皮層單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量。但是ALA究竟是通過何種機(jī)制調(diào)節(jié)了單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，還有待進(jìn)一步研究。

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Effects of alpha-lipoic acid on monoamine transmitters and monoamine oxidases in rats with chronic cerebral hypoperfusion.

ZHAO Ran-ran1,XU Xiao-chen2,WANG Ling1,LU Zhi-min3,ZHANG Wen-zhong1,LIU Ji-xiang4. Department of Emergency1,Department of Neurology2,Department of Urology3,Department of Neurosurgery4,the First Hospital of Handan,Handan 056002,Hebei,CHINA

Objective To explore the effects of alpha-lipoic acid(ALA)on monoamine neurotransmitters and monoamine oxidase in rats with chronic cerebral hypoperfusion(CCH).MethodsSixty healthy adult male Wistar rats were randomly assigned into four groups:SHAM group,CCH group,low-dose ALA therapy group(50 mg/kg)and high-dose ALA therapy group(100 mg/kg).Bilateral common carotid arteries occlusion was used in healthy adult male Wistar rats to establish CCH model.Rats in SHAM group were operated similarly to CCH group without occlusion of common carotid arteries.Morris water maze was used to evaluate spacial learning and memory function.HPLC was used to detect the levels of norepinephrine(NE),dopamine(DA)and 5-hydroxytryptamine(5-HT)in the forebrain cortex,and monoamine oxidase(MAO)was measured spectrophotometrically.ResultsCompared with SHAM group,the contents of NE,E,DA and 5-HT significantly decreased and MAO significantly increased in the CCH group,and the differences were statistically significant(P＜0.05).Both low-dose ALA and high-dose ALA could significantly increase NE,DAand 5-HT levels,and significantly decrease MAO level in the CCH rats(P＜0.05).ConclusionALAcould significantly improve behavioral alterations and restore central monoamine neurotransmitters system in rats with chronic cerebral hypoperfusion.

Chronic cerebral hypoperfusion(CCH);Alpha-lipoic acid(ALA);Monoamine transmitter; Monoamine oxidase

R-332

A

1003—6350（2015）23—3440—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.23.1248

2015-05-22)

趙冉冉。E-mail：a34251900@163.com