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    液質(zhì)聯(lián)用法篩選黃芩中清除自由基的活性物質(zhì)

    2015-04-14 01:35:02劉淵宏
    關(guān)鍵詞:過(guò)氧超氧定容

    劉淵宏,宋 龍

    (1.甘肅奇正藏藥有限公司,蘭州 730000;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,上海 201203)

    液質(zhì)聯(lián)用法篩選黃芩中清除自由基的活性物質(zhì)

    劉淵宏1,宋 龍2△

    (1.甘肅奇正藏藥有限公司,蘭州 730000;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,上海 201203)

    目的:用液質(zhì)聯(lián)用方法快速篩選黃芩藥材中用于清除人體內(nèi)自由基的活性物質(zhì)。方法:通過(guò)對(duì)黃芩中提取制得含4種單體(野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、黃芩素)的樣品溶液,分別與各自由基制得的溶液混合,以甲醇為對(duì)照孵化培養(yǎng),液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對(duì)黃芩提取液中各組分分離,以峰面積的變化來(lái)進(jìn)行考察。結(jié)果:清除自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,這4種成分經(jīng)過(guò)與超氧自由基、羥基自由基、過(guò)氧自由基反應(yīng)后含量都有不同程度的減少。結(jié)論:黃芩中4種成分對(duì)DPPH、超氧自由基、羥基自由基和過(guò)氧自由基都具有一定的清除作用。

    自由基;黃芩;液質(zhì)聯(lián)用

    自由基是導(dǎo)致人體衰老、癌癥的主要誘因,為近代科學(xué)研究所重視。在人體自由基中,活性氧(ROS)占到自由基總量的95%,其中人體內(nèi)重要的活性氧自由基包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、脂氧自由基被認(rèn)為是抗自由基活性物質(zhì)清除自由基性能的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[1-2]。為防治自由基對(duì)人體產(chǎn)生的危害,抗自由基物質(zhì)開(kāi)發(fā)成為科學(xué)研究的重點(diǎn)。在生物尤其植物中存在著大量的天然抗自由基化合物,其副作用很低、種類多且易于應(yīng)用,成為抗自由基物質(zhì)開(kāi)發(fā)的重要方向[3-5]。

    天然產(chǎn)物中黃酮類物質(zhì)對(duì)自由基有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。黃芩作為傳統(tǒng)中藥,目前已被列入世界眾多國(guó)家的藥典,如中國(guó)、韓國(guó)、日本等。其主要活性成分即為黃酮類成分,如黃芩苷、黃芩素等,且這些成分的抗氧化、抗自由基作用也受到科學(xué)研究的重視。與此同時(shí),黃芩地上部分(莖葉)中黃酮類物質(zhì)以野黃芩苷、野黃芩素為主,具有抗氧化、抗自由基的作用。但這4種成分對(duì)人體內(nèi)重要自由基清除活性,卻未得到深入研究。

    抗自由基物質(zhì)評(píng)價(jià)主要有體外評(píng)價(jià)和體內(nèi)評(píng)價(jià),體外評(píng)價(jià)如ABTS自由基陽(yáng)離子清除實(shí)驗(yàn)、超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)、羥自由基清除實(shí)驗(yàn)、脂氧自由基清除實(shí)驗(yàn)等[6-7];體內(nèi)評(píng)價(jià)常采用小鼠或大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,測(cè)定結(jié)果能夠真實(shí)反映抗自由基物質(zhì)在生物體內(nèi)的清除活性,但由于檢測(cè)指標(biāo)多而復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴等原因,并不適合抗自由基物質(zhì)的前期篩選。

    為深入研究黃芩中的抗自由基活性,本文采用體外自由基評(píng)價(jià)方法,就黃芩中所含野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、黃芩素等4種成分對(duì)人體內(nèi)氧陰離子自由基、羥基自由基、脂氧自由基的清除作用進(jìn)行研究,為黃芩抗自由基物質(zhì)的前期篩選開(kāi)發(fā)研究提供重要的理論支撐。

    1 儀器與材料

    HH-S4電熱恒溫水浴鍋,北京科偉永興儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;YLD-6000 SHP生化培養(yǎng)箱,揚(yáng)州鴻都電子有限公司;AL204電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;Surveyor高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀,美國(guó)Finnigan。

    黃芩莖葉購(gòu)自陜西西安,經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥全草。對(duì)照品為野黃芩苷,含量98%,阿拉丁試劑(中國(guó))有限公司;Free Radical DPPH購(gòu)于美國(guó)Sigma公司(St.Louis,MO,USA);其他實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

    2 方法

    2.1 提取物制備

    準(zhǔn)確稱取黃芩地上部分6.60 g,采用熱回流法,加入350 mL甲醇,60℃提取4 h。在提取液中,按提取液中野黃芩苷含量為2%,等質(zhì)量添加野黃芩素;按黃芩苷含量為8%,等質(zhì)量添加黃芩素,制備為P (primary)液。

    野黃芩素、黃芩素為實(shí)驗(yàn)室自制。取野黃芩苷(或者黃芩苷)3.0 g,依次加入120 mL70%乙醇、20 mL濃硫酸,110℃加熱6 h,攪拌速率10 r/s。反應(yīng)結(jié)束后,加入6倍體積量純水,過(guò)濾并收集濾餅即為野黃芩素(或者黃芩素)。

    2.2 色譜總離子HPLC

    2.2.1 色譜條件 流動(dòng)相的選擇與優(yōu)化中分別采用乙腈-水、乙腈-乙酸-水、乙腈-甲酸-水、甲醇-水、甲醇-乙酸-水、甲醇-甲酸-水。通過(guò)圖譜的對(duì)比分析得出,在流動(dòng)相為乙腈、甲酸和水的條件下,采用全梯度洗脫模式能夠達(dá)到最優(yōu)的分離度和選擇性,優(yōu)化的梯度洗脫條件如下(乙腈:A,0.5%甲酸水:B):0 min,A:3%,B:97%;23 min,A:10%,B:90%;40 min,A:46%,B:54%;60 min,A:100%。流速控制在0.2 ml/min,考慮分離效率的同時(shí),兼顧色譜柱的柱填料(3 mm)和兼容后期的液質(zhì)聯(lián)用分析。

    液相色譜分析采用 Thermo Finnigan Surveyor HPLC系統(tǒng),經(jīng)過(guò)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)優(yōu)化后,為在分離過(guò)程獲得更好的選擇性、分離度、靈敏度和重復(fù)性,最終確定采用色譜柱為 Thermo Hypersil GOLD C18(3 mm,150×2.1 mm,i.d.,鍵合雜化填料)的反相柱,柱溫設(shè)定為40℃;數(shù)據(jù)以3D波長(zhǎng)采集,波長(zhǎng)范圍在190~800 nm全波長(zhǎng)掃描,PDA/UV檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。進(jìn)樣方式采用自動(dòng)進(jìn)樣,部分定量環(huán)進(jìn)樣模式(Partial loop),進(jìn)樣量2 μL;進(jìn)樣室溫度4℃。

    2.2.2 總離子色譜圖 量取P液經(jīng)0.45 um過(guò)濾器過(guò)濾其雜質(zhì),進(jìn)樣經(jīng)HPLC分析得出其全程譜圖。經(jīng)色譜指認(rèn),其中A峰為野黃芩苷,B峰為野黃芩素,C峰為黃芩苷,D峰為黃芩素。

    2.3 自由基制備

    2.3.1 DPPH的制備 精確稱取 0.0035 gDPPH,用無(wú)水甲醇溶解定容至50 ml容量瓶中標(biāo)為A液,儲(chǔ)存于0~4℃冰箱中備用。

    2.3.2 超氧自由基的制備 精確稱取0.0100 g核黃素用70%甲醇溶解定容至10 ml容量瓶中標(biāo)為B液;取0.0250 g甲硫氨酸溶解定容于25 ml容量瓶中標(biāo)為C液,以上制備液儲(chǔ)存于0~4℃冰箱中備用。

    2.3.3 過(guò)氧自由基制備 精確稱取0.3025 g卵磷脂溶于30 ml磷酸鹽緩沖液中(50 mmol/L,pH =7.4)并超聲,冰水浴保持2 h,標(biāo)為E液;準(zhǔn)確稱取0.0148 g氯化鐵,定容至50 mL,標(biāo)為F液;準(zhǔn)確稱取0.0107 g抗壞血酸,定容至50 mL,標(biāo)為H液,以上制備液儲(chǔ)存于0~4℃冰箱中,備用。

    2.3.4 羥基自由基的制備 精確稱取0.0414 g水楊酸定容至50 mL,標(biāo)為I液;準(zhǔn)確稱取0.3006 g七水硫酸亞鐵晶體,定容至100 mL,標(biāo)為J液;精確稱取0.0564 g過(guò)氧化氫溶液,定容至50 mL,標(biāo)為K液,以上制備液儲(chǔ)存于0~4℃冰箱中備用。

    2.4 自由基測(cè)定

    2.4.1 DPPH清除率 實(shí)驗(yàn)組準(zhǔn)確量取2.5 mLP液和2.5mLA液混勻,37℃恒溫避光孵化2 h;對(duì)照組準(zhǔn)確量取2.5 mLP液和2.5 mL甲醇混勻,37℃恒溫避光孵化2 h。

    2.4.2 超氧自由基清除率 實(shí)驗(yàn)組準(zhǔn)確量取2.0 mlP液、1.0 mLB液、1.0 mLC液混勻,在254 nm和365 nm紫外燈下避光孵化2 h;對(duì)照組準(zhǔn)確量取2.0 mlP液和2.0 mL甲醇混勻,在254 nm和365 nm紫外燈下避光孵化2 h。

    2.4.3 過(guò)氧自由基清除率 實(shí)驗(yàn)組準(zhǔn)確量取1.0 mLP液、5.0 mLE液、2.0 mLF液、1.0 mlH液混勻,37℃恒溫避光孵化4 h;對(duì)照組準(zhǔn)確量取1.0 mLP液、5.0 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH= 7.4)、2.0 mLF液、1.0 mlH液混勻,37℃恒溫避光孵化4 h。

    2.4.4 羥基自由基清除率 實(shí)驗(yàn)組準(zhǔn)確量取5.0 mLP液、2.0 mLI液、2.0 mLJ液、2.0 mLK液,依次加入混勻,37℃恒溫避光孵化2 h。對(duì)照組準(zhǔn)確量取5.0 mLP液、2.0 mLI液、2.0 mLJ液、2.0 mL去離子水依次加入混勻,37℃恒溫避光孵化2 h。自由基清除率計(jì)算公式:對(duì)于一個(gè)自由基實(shí)驗(yàn)體系,通過(guò)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)應(yīng)譜峰面積的變化,就可以利用計(jì)算公式來(lái)評(píng)價(jià)相應(yīng)組分的清除自由基活性,其計(jì)算公式如下:100%。其中PAcontrol是對(duì)照組的峰面積,PAexp是實(shí)驗(yàn)組的峰面積。

    2.5 色譜圖中組分物質(zhì)的鑒定

    不同自由基評(píng)價(jià)色譜圖中4種成分(野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、黃芩素)的鑒定,是對(duì)比4種物質(zhì)各自的保留時(shí)間、UV光譜數(shù)據(jù)、MS以及MS2數(shù)據(jù),并通過(guò)對(duì)各自物質(zhì)的裂解規(guī)律討論進(jìn)行驗(yàn)證,并參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-22]。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 超氧自由基的評(píng)價(jià)

    圖1顯示,峰1表示野黃芩苷,峰2表示野黃芩素,峰3表示黃芩素,自由基色譜數(shù)據(jù)。

    3.2 羥基自由基評(píng)價(jià)

    圖2表2顯示,4種成分(野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、黃芩素)對(duì)超氧自由基、羥基自由基、過(guò)氧自由基具有一定的清除作用。比較而言,4種成分對(duì)3種自由基總體效果為:過(guò)氧自由基>羥基自由基>超氧自由基。這種效果排序驗(yàn)證了前人對(duì)黃芩提取物藥理作用的研究,也驗(yàn)證了黃芩全草提取物在擴(kuò)張血管、改善血液微循環(huán)、提高供血水平方面的應(yīng)用。

    圖1 超氧自由基活性分子篩選前后對(duì)照?qǐng)D

    表1 超氧自由基活性分子篩選數(shù)據(jù)分析

    表2 羥基自由基活性分子篩選數(shù)據(jù)分析

    圖2 羥基自由基活性分子篩選前后對(duì)照?qǐng)D

    由清除超氧自由基實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分析數(shù)據(jù)及譜圖可知,經(jīng)測(cè)定野黃芩苷對(duì)超氧自由基的清除率18.98%,黃芩苷對(duì)超氧自由基的清除率1.09%,黃芩素對(duì)超氧自由基的清除率24.38%,其他成分無(wú)表觀清除作用。由野黃芩苷、黃芩苷、黃芩素對(duì)超氧自由基的清除效果可知,其各自A環(huán)上的鄰羥基與其清除作用密切相關(guān),而野黃芩素的失效,很可能是因?yàn)橐包S芩苷受到超氧自由基的影響,A環(huán)7位脫去糖醛酸轉(zhuǎn)化為野黃芩素,因而掩飾了其真實(shí)效用。漢黃芩苷、白楊素-7-葡萄糖醛酸苷則是受到其B環(huán)上缺少羥基及其A環(huán)上缺失鄰羥基的原因,因而不具備超氧自由基的清除效果。

    4 小結(jié)

    黃芩中4種成分對(duì)3種自由基的作用可知,針對(duì)不同自由基,它們的作用效果并不相同。比較而言,黃芩素、野黃芩苷對(duì)超氧自由基的效果較好;黃芩苷對(duì)羥基自由基的效果較好;野黃芩素、黃芩素對(duì)過(guò)氧自由基的效果較好;比較野黃芩苷和野黃芩素對(duì)于過(guò)氧自由基清除作用,也驗(yàn)證野黃芩苷有效藥理作用代謝成分為野黃芩素的研究報(bào)道,同時(shí)本研究為黃芩抗自由基物質(zhì)的前期篩選開(kāi)發(fā)研究提供重要的理論依據(jù)。

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    Screening Bioactive Constituents of Scavenging Free Radicals in Scutellaria baicalensis Georgi by Using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

    LIU Yuan-hong1,SONG Long2△
    (1.Qizheng Tibetan Medicine Co.LTD.Gansu Lanzhou 730000,China;2.College of Pharmacy,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China)

    Objectives:To rapidly screen bioactive constituents of scavenging body free radicals in Scutellaria baicalensis Georgi by using Liquid Chromatography-Mas Spectrometry(LC-MS).Methods:Mix scutellarin,baicalin,scutellarein,and baicalein sample solution with each free radical solution respectively and with methanol as control incubation cultivation,using LC-MS to detect the peak area change of each component.Results:After four components with the super oxygen free radical,hydroxyl free radical,oxygen free radical reacting,their content reduced in varying degree.Conclusions:Four components in Scutellaria baicalensis Georgi have certain scavenging effect against DPPH,superoxide free radicals,hydroxyl free radicals and peroxide free radicals.

    Free radicals;Scutellaria baicalensis Georgi;LC-MS

    R965.1

    :B

    :1006-3250(2015)09-1156-04

    2015-03-02

    劉淵宏,男,工程師,從事藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

    △通訊作者:宋 龍,男,醫(yī)學(xué)博士,從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究,Tel:021-51322203,E-mail:sl1976@sina.cn。

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