人全血IL-1β 試驗在醫(yī)療器械體外熱原檢測中的應(yīng)用前景探討

范春光 孫立魁 劉成虎 李娜 侯麗 國家食品藥品監(jiān)督管理局濟南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評價重點實驗室 （濟南 250101）

1.背景

熱原檢測是醫(yī)療器械生物學(xué)安全評價中的重要項目。醫(yī)療器械熱原反應(yīng)主要分為內(nèi)毒素介導(dǎo)的熱原反應(yīng)、材料介導(dǎo)的熱原反應(yīng)[1]以及病毒[2]、真菌及其碎片[3]介導(dǎo)的熱原反應(yīng)。其中材料介導(dǎo)的熱原反應(yīng)物主要有內(nèi)源性熱原（如IL-1、IL-6, TNFα、INF-γ）、前列腺素、誘導(dǎo)劑（如多聚核糖核苷酸、多聚生物原酸）、干擾體溫調(diào)節(jié)中樞的物質(zhì)（如LSD、可卡因、嗎啡）、氧化磷酸化解偶聯(lián)劑（如二硝基酚）、細菌外毒素（如TSST-1、SEA、Spe F）、神經(jīng)遞質(zhì)（如去甲腎上腺素）以及某些應(yīng)用情況下的金屬（如鎳鹽）[1]。常見的致熱原多為外致熱原，外致熱原進入人體后可激活體內(nèi)產(chǎn)生致熱原細胞如單核細胞、巨噬細胞等[4]，使其產(chǎn)生IL-1[5], IL-6, TNFα[6]等內(nèi)生致熱原，內(nèi)生致熱原可通過血-腦脊液屏障直接作用于體溫調(diào)節(jié)中樞使調(diào)定點上移，機體產(chǎn)熱增多散熱減少從而引起發(fā)熱。

目前，醫(yī)療器械熱原檢測試驗共有兩種：鱟試劑法（細菌內(nèi)毒素檢測法）和兔法。其中鱟試劑法是通過檢測醫(yī)療器械浸提液中細菌內(nèi)毒素的含量來反映醫(yī)療器械致熱原的情況。而兔法則是將醫(yī)療器械浸提液經(jīng)耳緣靜脈注入兔體內(nèi)后根據(jù)兔的體溫變化來反映樣品熱原情況。傳統(tǒng)的方法有其局限性，鱟試劑法的局限性有以下幾點：（1）如前所述，除細菌內(nèi)毒素以外還有很多種致熱原，而鱟試劑法只能檢測細菌內(nèi)毒素，所以它的檢測譜不全面。（2）它只能檢測醫(yī)療器械浸提液。（3）鱟資源有限。兔法的局限性有以下幾點：（1）兔與人有種屬差異，兔熱原反應(yīng)的情況不能完全等同于人的情況。（2）兔法同樣只能檢測醫(yī)療器械浸提液；（3）兔法穩(wěn)定性比較差。（4)兔法為動物實驗，而體外試驗替代動物實驗也是國內(nèi)外的發(fā)展趨勢。

2009 年，歐洲藥典收錄了體外熱原檢查法，美國FDA 也接受了5 種基于人免疫細胞的注射用藥熱原體外試驗法[7]。這一類方法將供試品與人全血或細胞系孵育，然后測定產(chǎn)生的細胞因子的量來反映供試品中熱原物質(zhì)的量。研究[8]表明，人全血IL-1β 試驗是較為理想的體外檢測法。在本實驗中，我們驗證了人全血IL-1β 試驗的效果，并探討了此方法在醫(yī)療器械體外熱原檢測中應(yīng)用的可行性。

2.試驗材料及儀器

2.1 試驗材料

人抗凝新鮮全血（至少4 人混合），無菌無熱原生理鹽水（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號：1D13051304），人IL-1β ELISA 試劑盒（ExCell，批 號：ZKZFBZAB01）， 脂 多 糖O113（LPS O113）（LIST BIOLOGICAL，批號：4331B1），脂磷壁酸（LTA）（SIGMA，批號：022M4026V）

2.2 儀器

采血管（BD，K2EDTA，批號：2030578），采血針（BD，0.6×20mm×180mm，批號：1349187），無菌無熱原1.5mL 反應(yīng)管（AXYGEN，批號：311-08-081），15mL 反應(yīng)管（AXYGEN，批號：100525-02904），微量移液器（eppendorf，1μL-5mL），無菌無熱原槍頭（湛江博康海洋生物有限公司，250μL-1mL，批號：20120730），離心機（SIGMA，型號：1-14K），37?C 培養(yǎng)箱（memmert，型號：ICP700），250?C 烘箱（BINDER，型號：FED240），酶標(biāo)儀（Thermo，型號：Multiscan MK3）

3.試驗方法

3.1 采血

選取4 名健康志愿者（24-29 歲，三男一女，兩周內(nèi)未服藥）采用無菌無熱原抗凝采血管靜脈采血，采血后經(jīng)白細胞分類計數(shù)以排除感染，等體積混合，4 小時內(nèi)使用。

3.2 加樣孵育

（1）將1mL 生理鹽水加入1.5mL EP 管，平行準(zhǔn)備數(shù)管，另取數(shù)管分別加入100μL 濃度為0、100、200、400、600、800 pg/mL（溶于生理鹽水）的LPS O113，分別標(biāo)記為R0、R1、R2、R3、R4、R5，用于制作濃度反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）取1.5mL EP 管加入1mL 生理鹽水，再加入100μL 0.5 μg/mL 的LTA 溶液；另取1.5mL EP 管加入900uL 生理鹽水，再加入100μL 0.5 μg/mL 的LTA 溶液，再加入100μL R2 (200 pg / mL)，用于計算內(nèi)毒素回收率。在加入血液之前混合物要在無菌操作臺放置至少1h。

（3）將100μL 混勻的抗凝鮮血加入到每一個反應(yīng)管內(nèi)，使總體積為1200μL，蓋上各反應(yīng)管，輕輕混勻。

（4）將反應(yīng)管靜置于37?C，5%CO2 潮濕培養(yǎng)箱內(nèi)過夜（14-24 h），13000g 離心2min，取上清。

3.3 測定

按人IL-1β ELISA 試劑盒說明書操作測定各反應(yīng)管上清IL-1β 的含量。

3.4 計算

（1）根據(jù)試劑盒中IL-1β 標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度與相應(yīng)的吸光度值（OD 值）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)得到的回歸方程計算各反應(yīng)管內(nèi)IL-1β 的含量。

（2）根據(jù)不同濃度梯度的內(nèi)毒素O113 的量與相應(yīng)的IL-1β 的含量建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算回歸方程。

（3）計算試驗溶液的內(nèi)毒素當(dāng)量及其內(nèi)毒素回收率。根據(jù)曲線回歸方程分別計算出試驗溶液和加內(nèi)毒素后的試驗溶液的內(nèi)毒素含量A 和B，按照以下公式計算該試驗條件下內(nèi)毒素的回收率?；厥章? (B-A)/ R2×100%。當(dāng)回收率在50%～200%之間，則認為在此試驗條件下試驗溶液不干擾試驗系統(tǒng)。

4.結(jié)果

4.1 根據(jù)試劑盒中IL-1β 標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度（y）與相應(yīng)的吸光度值（OD 值）（x）建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線1（圖1）。線性回歸方程為：y = 82.345x2+ 166.63x – 3.4265，R = 0.999

4.2 根據(jù)以上回歸方程計算得到各反應(yīng)管內(nèi)IL-1β的含量，根據(jù)不同濃度梯度的內(nèi)毒素O113 的量（x）與相應(yīng)的IL-1β 的含量（y）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線2（圖2）并得到回歸方程：y = 112.34Ln(x) - 281.12，R= 0.990，線性范圍（pg / mL）：100 – 800，檢出限：100 pg / mL。

4.3 根據(jù)曲線回歸方程得到了試驗溶液的內(nèi)毒素當(dāng)量A 為105.8 pg / mL。加內(nèi)毒素后的試驗溶液的內(nèi)毒素當(dāng)量B 為219.0 pg / mL?；厥章? (BA)/ R2 ×100%=56.6%。回收率在50%～200%之間，符合要求。

圖1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線1

5.討論

多年以來，人們一直在研究熱原體外試驗方法，研究應(yīng)用不同實驗材料的可行性，如新鮮人全血、凍存人全血、人單核細胞系[7]、兔血[9]等，研究檢測不同細胞因子的敏感性，如IL-1、IL-6、TNFα、INF-γ 等[8,9]。眾多研究表明，人全血IL-1β 試驗是最為理想的體外檢測法。

在醫(yī)療器械熱原檢測中，人全血IL-1β 試驗與傳統(tǒng)方法相比有諸多優(yōu)勢。與鱟試劑法相比，此試驗方法有以下優(yōu)勢：（1）檢測范圍更廣，此方法不僅可以檢測內(nèi)毒素類致熱原，還將大部分非內(nèi)毒素類的致熱原如細菌外毒素、病毒、真菌及其碎片及核糖核苷酸等能夠刺激機體產(chǎn)生IL-1β 的外致熱原納入檢測范圍。在本實驗中，LTA 為非內(nèi)毒素類的致熱原，鱟試劑法是無法檢測的。（2）在最低檢出限方面，鱟試劑法所有內(nèi)毒素的閾值是100pg/mL 或1ng/mL，人全血法為1pg/mL 至10ng/mL 不等[10]，我們此次試驗的最低檢出限為100pg/mL，與以上研究結(jié)果相符，其最低檢出限優(yōu)于鱟試劑法。（3）能夠?qū)崿F(xiàn)定量分析。鱟試劑法是采用的定性分析，對于高于其內(nèi)毒素閾值的物質(zhì)均發(fā)生凝集反應(yīng)，無法實現(xiàn)定量分析，本法可在其線性范圍內(nèi)實現(xiàn)定量分析。相較于兔法，此試驗方法優(yōu)勢如下：①采用人全血檢測，不存在種屬差異問題，更能夠準(zhǔn)確、客觀反應(yīng)致熱原在人體內(nèi)的熱原反應(yīng)情況，結(jié)果更可信。②在最低檢出限方面，LTA 濃度0.5 μg/mL 為兔法的檢出限[8]，在本次試驗中此濃度的LTA 也能夠成功定量，但兔法結(jié)果可重復(fù)性較差，結(jié)果不夠穩(wěn)定，而新方法操作性強，便于通過制定統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，實現(xiàn)較高的穩(wěn)定性。③兔法是動物試驗，本方法是體外實驗符合3R 原則。 若新方法應(yīng)用于醫(yī)療器械的熱原檢測，與傳統(tǒng)方法相比除以上優(yōu)勢以外，理論上還有一個獨特的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的醫(yī)療器械的熱原檢測方法都是只能檢測醫(yī)療器械浸提液，研究表明，按照現(xiàn)有的浸提方法我們無法保證醫(yī)療器械中致熱原特別是其表面粘附的細菌碎片等殘留物有效浸提出來[11]，而且有研究發(fā)現(xiàn)，移植物表面粘附的細菌碎片釋放的內(nèi)毒素是導(dǎo)致移植失敗的重要原因[12]。而在新方法中，某些醫(yī)療器械如小型支架或易于取樣和制備的醫(yī)療器械可以直接放入反應(yīng)容器與人新鮮全血一起孵育，這樣就可以將醫(yī)療器械表面不容易浸提下來的致熱原納入檢測范圍，結(jié)果會更加客觀、準(zhǔn)確。

人全血IL-1β 試驗在醫(yī)療器械熱原檢測中應(yīng)用之前，還要解決很多問題：新方法還需要在不同實驗室之間進行比對，制定試驗系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，研究試驗系統(tǒng)的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性，研究新方法的具體適用范圍，研究樣品制備方式，研究制定科學(xué)的判定標(biāo)準(zhǔn)等。這一系列問題都需要在接下來的工作中解決。相信在后續(xù)的工作中，新方法會不斷完善，最終能夠成熟地應(yīng)用于醫(yī)療器械的生物學(xué)安全評價系統(tǒng)中，為醫(yī)療器械的臨床使用提供更為有效的保障。

[1] Test for systemic toxicity[S]. ISO 10993 Biological evaluation of medical devices, 1993, 11: 21.

[2] Atkins E, Huang W C. Studies on the pathogenesis of fever with influenzal viruses. I. The appearance of an endogenous pyrogen in the blood following intravenous injection of virus [J]. Exp Med, 1958, 107(3): 383-401.

[3] Kobayashi G S, Friedman L. Characterization of the Pyrogenicity of Candida Albicans, Saccharomyces Cerevisiae, and Cryptococcus Neoformans [J]. Bacteriol, 1964, 88(3): 660-666.

[4] Beeson P B. Temperature-elevating effect of a substance obtained from polymorphonuclear leucocytes (abstract) [J]. Clin Invest, 1948, 27: 524.

[5] Dinarello C A, Shparber M, Kent E F, et al. Production of leucocytic pyrogen from phagocytes of neonates [J]. Infect Dis, 1981, 144(4): 337-343.

[6] Dinarello C A, Cannon J G, Wolff S M, et al. Tumor necrosis factor (cachectin) is an endogenous pyrogen and induces production of interleukin 1 [J]. Exp Med, 1986, 163(6): 1433-1450.

[7] HARTUNG T. Statement on the validity of the in-vitro pyrogen test (European Centre for the Validation of Alternative Methods, Ispra, 2006).

[8] 何開勇, 人全血體外熱原實驗方法研究[C]. 中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會第十屆年會21 分會場論文匯編, 2008, 267-272.

[9] 李冠民, 黃清泉, 張云河, 等. 用全血或細胞替代家兔進行熱原檢查的方法研究[J]. 實驗動物科學(xué)與管理, 2003, 20: 148-149.

[10] 賀爭鳴, 邢瑞昌. 熱原質(zhì)的檢測方法(一) [J]. 中國實驗動物學(xué)雜志, 2001, 11(3): 156-157.

[11] Hasiwa M, Kullman K, von Aulock S, et al. An in vitro pyrogen safety test for immune-stimulating components on surfaces submitted [J]. Biomaterials, 2007. 28(7): 1367-75.

[12] Williams D. Endotoxins and medical devices: the significance of dead bacteria [J]. Med Device Technol, 2003, 14(2): 8-11.