液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)牛奶中苯并咪唑類(lèi)藥物

（北京市飼料監(jiān)察所）

苯并咪唑類(lèi)藥物是一類(lèi)含有2 個(gè)氮原子的雜環(huán)化合物，自20世紀(jì)80年代初問(wèn)世以來(lái)，相繼合成了許多廣譜、高效、低毒的藥物，其中主要的有甲苯咪唑、阿苯噠唑、噻苯咪唑、氟苯咪唑、芬苯噠唑等。它們的基本作用相似，主要對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)具有較強(qiáng)的驅(qū)殺作用，有的不僅對(duì)成蟲(chóng)，而且對(duì)幼蟲(chóng)也有效。但這類(lèi)藥物具有致畸作用，對(duì)人類(lèi)也可引起與動(dòng)物同樣的潛在危害。隨著苯并咪唑類(lèi)藥物的廣泛應(yīng)用，其產(chǎn)生的毒副作用還會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生直接的危害，因而苯并咪唑類(lèi)藥物在牛奶中的殘留問(wèn)題已經(jīng)日益引起人們的關(guān)注。

1 檢測(cè)過(guò)程

牛奶中的苯并咪唑類(lèi)藥物經(jīng)乙酸乙酯提取，氮?dú)獯蹈珊笥盟峄掖紡?fù)溶，正己烷脫脂；經(jīng)MCX陽(yáng)離子固相萃取小柱凈化，氨化甲醇洗脫后氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔锛尤?0%甲醇+0.1%甲酸水溶液復(fù)溶，過(guò)0.22 μm濾膜后供液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 試劑和儀器設(shè)備

2.1 試劑

以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純?cè)噭?，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

阿苯噠唑、阿苯噠唑砜、阿苯噠唑亞砜、胺基阿苯噠唑、噻苯咪唑、5-羥基噻苯咪唑、甲苯咪唑、胺基甲苯咪唑、羥基甲苯咪唑、芬苯噠唑、芬苯噠唑砜、奧芬噠唑、氟苯咪唑和2-胺基-氟苯咪唑等苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（10 μg/mL），由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；乙酸乙酯；氯化鈉；乙醇；鹽酸；正己烷；甲醇，色譜純；乙腈，色譜純；50%甲酸甲醇溶液，取甲酸50 mL加甲醇至100 mL，混勻即得；2%碳酸鈉水溶液，稱(chēng)取碳酸鈉2 g，用水溶解并稀釋至100 mL，混勻即得；酸化乙醇溶液（乙醇+0.1 mol/L鹽酸溶液，V/V＝2∶1），量取乙醇20 mL加入0.1 mol/L鹽酸溶液10 mL，混勻即得；5%氨水甲醇溶液，取氨水5 mL加甲醇至100 mL，混勻即得；20%甲醇+0.1%甲酸水溶液，量取甲醇20 mL和甲酸0.1 mL，用水溶解并稀釋至100 mL，混勻即得；0.1%甲酸乙腈溶液，取甲酸0.1 mL加乙腈至100 mL，混勻即得；0.1%甲酸水溶液，取甲酸0.1 mL加水至100 mL，混勻即得；0.1 mol/L鹽酸溶液，取鹽酸9 mL加水稀釋至1 000 mL，混勻即得。

2.2 主要儀器與設(shè)備

液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀，Waters公司2695-Quattro micro，配電噴霧離子源；分析天平（感量0.01 g），AR3130；電子天平（感量0.0001 g），AX-105；固相萃取裝置；氮吹儀；旋渦混合器；高速冷凍離心機(jī)，D-37520型；離心管，50 mL；玻璃試管，10 mL；MCX固相萃取柱，60 mg/3 cc；微孔濾頭，0.22 μm。

2.3 線(xiàn)性試驗(yàn)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/mL）

準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的5-羥基噻苯咪唑、噻苯咪唑、胺基阿苯噠唑砜、阿苯噠唑亞砜、阿苯噠唑砜、奧芬噠唑、羥基甲苯咪唑、胺基甲苯咪唑、2-胺基-氟苯咪唑、芬苯噠唑砜、甲苯咪唑、阿苯噠唑、氟苯咪唑、芬苯噠唑?qū)φ掌?，?0%的甲酸甲醇溶液分別配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。配制完后，-20 ℃保存。

（2）苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（10 μg/mL）

分別準(zhǔn)確吸取5-羥基噻苯咪唑、噻苯咪唑、胺基阿苯噠唑砜、阿苯噠唑亞砜、阿苯噠唑砜、奧芬噠唑、羥基甲苯咪唑、胺基甲苯咪唑、2-胺基-氟苯咪唑、芬苯噠唑砜、甲苯咪唑、阿苯噠唑、氟苯咪唑、芬苯噠唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻即得。配制完后，4 ℃保存。

（3）苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（1 μg/mL）

準(zhǔn)確吸取苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（10 μg/mL）1.0 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻即得。配制完后，4 ℃保存。

2.3.2 樣品的制備

（1）提取

稱(chēng)取（2±0.02）g試料加入2%碳酸鈉溶液0.5 mL，再加入氯化鈉2 g，加入乙酸乙酯8 mL，渦旋混合后，中速振蕩提取5 min，6 000 r/min離心5 min，取上清液，重復(fù)提取一次，合并上清液至離心管中。40 ℃下吹至近干，向離心管中加入酸化乙醇溶液5 mL，渦旋混合1 min，超聲5 min，再向離心管中加入正己烷5 mL，渦旋混合1 min，6 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷。再用正己烷5 mL重新脫脂一次，下層溶液作為備用液。

（2）凈化

MCX小柱依次用甲醇、2%甲酸水溶液各3 mL活化，取全部備用液過(guò)柱，控制流速為1 mL/min，依次用2%甲酸水溶液、甲醇各3 mL以同樣速度淋洗柱子，抽干，用5%氨水甲醇溶液3 mL洗脫于試管內(nèi)；洗脫液于40 ℃下氮?dú)獯蹈伞?/p>

殘余物加入20%甲醇+0.1%甲酸水溶液1 mL，超聲10 min，充分渦旋混勻；過(guò)0.22 μm濾膜后供液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2.3.3 測(cè)定

（1）液相色譜條件

色譜柱：Waters Xterra C18柱，（2.1×50）mm，1.7 μm；流動(dòng)相：A相，0.1%甲酸乙腈溶液，B相，0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫：洗脫程序見(jiàn)表1；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。（2）質(zhì)譜參考條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電離電壓：3.0 kV；源溫：110 ℃；霧化溫度：350 ℃；錐孔氣流速：50 L/h；霧化氣流速：450 L/h；測(cè)試藥物定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓、碰撞能量，結(jié)果見(jiàn)表2。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.3.4 線(xiàn)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表1 梯度洗脫程序

表2 苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物定性、定量離子對(duì)，錐孔電壓、碰撞能量和保留時(shí)間

線(xiàn)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果如表3所示。

從線(xiàn)性回歸方程及相關(guān)系數(shù)R2可以看出，14 種苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物在10～1 000 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，R2均大于0.99。

2.4 靈敏度試驗(yàn)

2.4.1 靈敏度試驗(yàn)方法

分別準(zhǔn)確吸取1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液10和20 μL，添加到2 g牛奶中，制得濃度為5 μg/kg和10 μg/kg的空白添加試料。按樣品提取與凈化步驟處理，殘余物加入20%甲醇+0.1%甲酸水溶液1 mL溶解，充分超聲、渦旋混勻，過(guò)0.22 μm濾膜后供高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，計(jì)算信噪比?？瞻自嚇影赐瑯拥姆椒ㄌ幚?，得到空白試樣的質(zhì)量色譜圖。

2.4.2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

空白牛奶試樣的測(cè)定結(jié)果表明，在相應(yīng)的保留時(shí)間均無(wú)雜質(zhì)干擾。檢測(cè)限（LOD）考察結(jié)果：按信噪比S/N＞3（PtP）計(jì)，苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物在5 μg/kg的添加水平上均符合要求，說(shuō)明苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物的檢測(cè)限均能達(dá)到5 μg/kg。定量限（LOQ）考察結(jié)果：按信噪比S/N＞10（PtP）計(jì)，苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物在10 μg/kg的添加水平上均符合要求，說(shuō)明苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物的定量限均能達(dá)到10 μg/kg。

表3 苯并咪唑類(lèi)藥物回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R2）

2.5 準(zhǔn)確度和精密度考察

2.5.1 試驗(yàn)方法

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白牛奶10、50、100和200 μg/kg共4 個(gè)不同濃度的苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物，進(jìn)行回收率試驗(yàn)，各濃度進(jìn)行5 個(gè)樣品平行試驗(yàn)。按樣品提取與凈化步驟處理，殘余物加入20%甲醇+0.1%甲酸水溶液1 mL溶解，充分渦旋混勻，過(guò)膜后供高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。重復(fù)3 次，求批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.5.2 結(jié)果計(jì)算

式中：X—供試試料中苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物殘留量（μg/kg）；Cs—基質(zhì)匹配溶液中相應(yīng)苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物濃度（ng/mL）；C—供試試料溶液中相應(yīng)苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物濃度（ng/mL）；As—基質(zhì)匹配溶液中相應(yīng)苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物峰面積；A—供試試料溶液中相應(yīng)苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物峰面積；V—?dú)堄辔锒ㄈ蒹w積（mL）；m—供試試料質(zhì)量體積（g或mL）。

需要注意的是，計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留3 位有效數(shù)字。

2.5.3 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，在10、50、100和200 μg/kg添加濃度水平上，本方法在空白牛奶中的回收率平均為70%～120%。批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%。

3 結(jié)果與討論

3.1 線(xiàn)性范圍

苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液在10～1 000 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，R2均大于0.99，符合要求。

3.2 靈敏度

苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物在牛奶中的檢測(cè)限能達(dá)到5 μg/kg，定量限能達(dá)到10 μg/kg，均符合要求。

3.3 準(zhǔn)確度

本方法在10、50、100和200 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，牛奶中苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物的回收率均在70%～120%范圍內(nèi)，符合要求。

3.4 精密度

本方法在10、50、100和200 μg/kg添加濃度水平上，牛奶中苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均≤20%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均≤20%，符合要求。

表4 空白牛奶中苯并咪唑類(lèi)藥物添加回收率試驗(yàn)（n=5）

3.5 檢測(cè)方法的制定原因

為加強(qiáng)獸藥殘留監(jiān)控工作，保證動(dòng)物性食品衛(wèi)生安全，農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》，其中規(guī)定了甲苯咪唑、阿苯噠唑、噻苯咪唑、氟苯咪唑、芬苯噠唑及主要代謝物在牛奶中的最高殘留限量（MRL）。動(dòng)物源產(chǎn)品中苯并咪唑類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)方法，報(bào)道的有高效薄層色譜（HPTLC）等初篩方法、高效液相色譜熒光檢測(cè)器測(cè)定方法（HPLC-FLD）、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS和LC-MS｜MS）等測(cè)定方法。由于LCMS/MS方法具有操作簡(jiǎn)捷、靈敏度高、定性準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，所以將其應(yīng)用于牛奶中苯并咪唑類(lèi)藥物及其代謝物殘留檢測(cè)方法的研究中，以保障對(duì)該類(lèi)獸藥的殘留監(jiān)控。

3.6 樣品處理方法的確定

苯并咪唑類(lèi)藥物屬于弱堿類(lèi)化合物，在弱堿性條件下，呈游離分子狀態(tài)，在酸性條件下，該類(lèi)化合物質(zhì)子化。因此本方法提取時(shí)采用堿性條件下用乙酸乙酯進(jìn)行提取。

由于大多數(shù)苯并咪唑類(lèi)藥物溶于乙醇和稀鹽酸溶液，因此本方法在合并2 次提取液濃縮蒸干后，采用了酸化乙醇溶液溶解濃縮物，既可以脫去提取樣品中的蛋白質(zhì)，也可以充分溶解該類(lèi)藥物，進(jìn)一步經(jīng)正己烷脫脂后通過(guò)固相萃取方法進(jìn)行凈化。對(duì)固相萃取柱C18柱、HLB柱、MCX柱等進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：HLB和MCX的藥物添加回收率普遍較C18高；HLB和MCX之間差異不顯著，但是使用HLB時(shí)，酸性乙醇溶液溶解的濃縮物在上樣前需用碳酸鈉溶液中和至中性，而使用MCX柱時(shí)，酸性乙醇溶液溶解的濃縮物可以直接過(guò)柱，因此操作起來(lái)比較方便，所以最終選擇了用MCX固相萃取柱進(jìn)行凈化。

因此，本方法采用MCX柱，用甲醇、2%甲酸水溶液活化后，將提取液全部過(guò)柱，然后用5%氨化甲醇溶液洗脫，達(dá)到了理想的效果。另外，樣品經(jīng)氮吹儀濃縮、吹干后要充分超聲溶解。

3.7 離子對(duì)的確定

苯并咪唑類(lèi)藥物屬于歐盟指令96/23/EC附錄IB組所列物質(zhì)，根據(jù)歐盟2002/657/EC要求，要確證該類(lèi)物質(zhì)至少需要3 個(gè)識(shí)別點(diǎn)（IP），分別選擇了母離子以及對(duì)應(yīng)的2 個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的子離子作為定性依據(jù)，這樣1 個(gè)母離子獲得1 個(gè)IP點(diǎn)，對(duì)應(yīng)2 個(gè)子離子分別獲得1.5 個(gè)IP點(diǎn)，達(dá)到了4 個(gè)IP點(diǎn)，很好地滿(mǎn)足了歐盟有關(guān)法規(guī)的要求。