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    超聲波輔助復(fù)合酶法提取枸杞多糖工藝研究

    2015-04-12 09:36:00王杉杉馬韻升劉圣鵬虞鳳慧
    中國(guó)釀造 2015年7期
    關(guān)鍵詞:枸杞超聲波葡萄糖

    王杉杉,馬韻升,姚 剛,劉圣鵬,虞鳳慧,魏 征*

    (1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司,山東 濱州 256500;2.山東京博控股股份有限公司,山東 濱州 256500)

    枸杞(Lycium barbarum)子為茄科植物枸杞的干燥成熟果實(shí)[1],能滋補(bǔ)肝腎、益精明目,用于腰膝酸痛、眩暈耳鳴[2]。枸杞的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高,關(guān)于其營(yíng)養(yǎng)成分的報(bào)道[2-3]也很多,枸杞多糖(Lycium barbarumpolysaccharide,LBP)是枸杞中的主要活性成分之一,是一種水溶性蛋白多糖,已經(jīng)被研究證實(shí)具有提高免疫力、抗癌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血脂、抗脂肪肝等功效[4-8],具有很好的發(fā)展前景。

    目前,枸杞多糖的提取主要采用熱水浸提法,該方法比較簡(jiǎn)單,易于操作,但提取效率低,且較高的溫度容易破壞多糖結(jié)構(gòu),降低其生物活性[9]。酶法可以分解植物細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的成分,從而促進(jìn)胞內(nèi)有效成分的溶出[10-12];超聲輔助浸提則可利用超聲波的空化效應(yīng)及機(jī)械剪切作用來(lái)破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),同時(shí)強(qiáng)化傳質(zhì),以達(dá)到提高有效成分收率的目的[13-14]。這兩種方法因其提取條件溫和、提取效率高、提取時(shí)間短及綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)受到越來(lái)越多的關(guān)注。如果將二者結(jié)合,一方面可利用超聲增強(qiáng)復(fù)合酶的活性,提高其破壁效率;另一方面可通過(guò)超聲強(qiáng)化傳質(zhì)過(guò)程,促進(jìn)多糖溶解,有效縮短浸提時(shí)間,提高多糖得率[15-18]。

    本試驗(yàn)采用超聲波輔助復(fù)合酶法對(duì)枸杞多糖提取工藝進(jìn)行研究,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交設(shè)計(jì)對(duì)枸杞多糖的料液比、提取溫度、超聲時(shí)間、復(fù)合酶添加量進(jìn)行優(yōu)化,旨在獲得一個(gè)得率高、品質(zhì)好的枸杞多糖提取條件,從而為枸杞多糖的工業(yè)生產(chǎn)、開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    枸杞:寧夏;脂肪酶(200000U/g)、果膠酶(200000U/g):蘇柯漢濰坊生物工程有限公司;蛋白酶(200 000 U/g):南寧龐博生物工程有限公司;纖維素酶(20 000 U/g):實(shí)驗(yàn)室自制(畢赤酵母工程菌發(fā)酵);無(wú)水乙醇、葡萄糖、苯酚、硫酸(分析純):萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠(chǎng)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    DL-6M大型低速離心機(jī):長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)科技有限公司;752N-紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠(chǎng);FD-1A-50型冷凍干燥機(jī):北京博醫(yī)康有限公司;KQ-250B超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋:江蘇省金壇市融化儀器制造有限公司;JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器:上海浦東物理光學(xué)儀器銷(xiāo)售部。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 枸杞多糖提取工藝流程

    枸杞粉末→乙醇脫脂→超聲波輔助復(fù)合酶浸提→沸水浴滅酶→離心→Sevage法除蛋白→濃縮→冷凍干燥→枸杞多糖粗品

    1.3.2 枸杞多糖提取操作要點(diǎn)

    緩沖溶液的配制:分別配制0.1 mol/L的檸檬酸及檸檬酸鈉溶液,并按比例配成pH 4.6的緩沖溶液。

    復(fù)合酶液配制:稱(chēng)取等質(zhì)量的脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶和果膠酶,加入10倍體積的緩沖溶液,40 ℃水浴活化20 min。

    將枸杞置于陰涼處,自然晾干,將其粉碎。精確稱(chēng)取粉碎的枸杞粉末30 g,加入10倍體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇,于80 ℃水浴脫脂1 h,冷卻、離心、收集濾餅備用。按照不同的料液比、提取溫度、提取時(shí)間、復(fù)合酶(脂肪酶/蛋白酶/纖維素酶/果膠酶1∶1∶1∶1)添加量設(shè)計(jì)試驗(yàn),在180 W超聲功率條件下進(jìn)行超聲波輔助復(fù)合酶提取,沸水浴滅酶10 min,在4 000 r/min條件下離心10 min,過(guò)濾,Sevage法除蛋白,上清液進(jìn)行減壓濃縮至原體積的1/5,冷凍干燥得到枸杞多糖粗品。

    1.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

    葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取在105 ℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g,置于50 mL燒杯中加蒸餾水溶解,并全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,稀釋至刻度,另取10 mL該溶液于100 mL容量瓶中,稀釋至刻度,配成質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制:精密吸取0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL,分別置于25 mL比色管中,準(zhǔn)確補(bǔ)充水至2.0 mL,加入5%苯酚溶液1.0 mL,在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻,小心加入濃硫酸5.0 mL,在旋轉(zhuǎn)均勻器上小心混勻,冷卻后,用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490 nm處,以試劑空白溶液為參比,1 cm比色皿測(cè)吸光度值,制得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

    1.3.4 樣品多糖含量測(cè)定

    取干燥枸杞多糖供試品,按實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將其稀釋至合適倍數(shù),精確吸取待測(cè)液2 mL置于25 mL比色管,按照方法1.3.3顯色,用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算葡萄糖的質(zhì)量,計(jì)算樣品中多糖含量。多糖含量的計(jì)算公式如下:

    式中:C為供試液中葡萄糖的質(zhì)量濃度,μg/mL;D為樣品液的稀釋因素:F為換算因子;m為樣品的質(zhì)量,g。

    1.3.5 多糖得率的計(jì)算

    枸杞多糖的得率計(jì)算公式如下:

    式中:Y為枸杞多糖得率,%;m1為枸杞多糖質(zhì)量,g;m0為粗多糖質(zhì)量,g。

    1.3.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    料液比的確定:分別設(shè)定料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL),在超聲功率180 W,提取溫度為55 ℃,復(fù)合酶添加量0.2%條件下提取40 min,考察不同料液比對(duì)多糖得率的影響。

    提取溫度的確定:分別設(shè)定提取溫度為35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃,在超聲功率180 W,料液比為1∶40(g∶mL),復(fù)合酶添加量0.2%條件下提取40 min,考察不同提取溫度對(duì)多糖得率的影響。

    超聲時(shí)間的確定:分別設(shè)定提取時(shí)間為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min,在超聲功率180 W,料液比為1∶40(g∶mL),提取溫度為55 ℃,復(fù)合酶添加量0.2%條件下提取,考察不同超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響。

    復(fù)合酶添加量:分別設(shè)定復(fù)合酶(脂肪酶/蛋白酶/纖維素酶/果膠酶1∶1∶1∶1)添加量為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%,在超聲功率180 W,料液比為1∶40(g∶mL),提取溫度為55 ℃條件下提取50 min,考察不同復(fù)合酶添加量對(duì)多糖得率的影響。

    1.3.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取料液比(A)、超聲時(shí)間(B)、提取溫度(C)和復(fù)合酶添加量(D)4個(gè)因素,進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),以枸杞多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),最終確定枸杞多糖提取的最優(yōu)工藝條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

    表1 枸杞多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for polysaccharide from Lycium barbarum extraction conditions optimization

    2 結(jié)果與分析

    2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

    采用硫酸-苯酚法測(cè)定不同質(zhì)量的葡萄糖在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值,以葡萄糖含量(x)為橫坐標(biāo),吸光度值(y)為縱坐標(biāo),繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),結(jié)果如圖1所示。

    由圖1可知,在葡萄糖含量0~0.12 mg范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程為y=8.002 1x-0.015 5,擬合系數(shù)R2=0.998 1,表明葡萄糖含量與吸光度值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

    圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of glucose

    2.2 各單因素對(duì)枸杞多糖提取效果的影響

    2.2.1 料液比對(duì)提取效果的影響

    不同料液比條件下的枸杞多糖得率結(jié)果如圖2所示。

    圖2 料液比對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid liquid ratio on the yield of polysaccharide from Lycium barbarum

    從圖2可以看出,當(dāng)料液比<1∶40(g∶mL)時(shí),枸杞多糖得率隨著料液比的升高而升高,可能是當(dāng)料液比較低時(shí),溶液黏稠度較大,超聲波處理時(shí),不易形成空化現(xiàn)象;當(dāng)料液比為1∶40(g∶mL)時(shí),枸杞多糖得率達(dá)到31.132%;之后隨著料液比的升高反而會(huì)使枸杞多糖得率降低,可能是隨著溶劑用量的增大,溶液中底物與酶的質(zhì)量濃度也隨之下降,有效反應(yīng)碰撞減少。因此,選擇料液比1∶40(g∶mL)最佳。

    2.2.2 提取溫度對(duì)提取效果的影響

    不同提取溫度條件下的枸杞多糖得率結(jié)果如圖3所示。

    從圖3可以看出,枸杞多糖得率隨著溫度的升高而升高;當(dāng)溫度為55 ℃時(shí),枸杞多糖得率達(dá)到42.621%;之后隨著溫度繼續(xù)升高,枸杞多糖得率顯著降低。溫度影響酶的活性,適當(dāng)?shù)纳邷囟瓤梢蕴岣呙傅幕钚?,提高枸杞多糖得率,但?dāng)溫度過(guò)高時(shí),酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,活性急速下降,而使枸杞多糖得率降低。因此,選擇提取溫度為55 ℃最佳。

    圖3 溫度對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the yield of polysaccharide from Lycium barbarum

    2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

    不同超聲時(shí)間條件下的枸杞多糖得率結(jié)果如圖4所示。

    圖4 超聲時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on the yield of polysaccharide from Lycium barbarum

    從圖4可以看出,超聲時(shí)間<50 min時(shí),枸杞多糖隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大;超聲時(shí)間為50 min時(shí),枸杞多糖得率39.742%;當(dāng)>50 min時(shí),枸杞多糖得率反而下降,可能因?yàn)槌晻r(shí)間較長(zhǎng),超聲波提供的能量過(guò)高,此條件下多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞,得率降低。因此,選擇超聲時(shí)間為50 min。

    2.2.4 復(fù)合酶添加量對(duì)提取效果的影響

    不同復(fù)合酶添加量條件下的枸杞多糖得率結(jié)果如圖5所示。

    圖5 復(fù)合酶添加量對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.5 Effect of compound enzymes addition on the yield of polysaccharide from Lycium barbarum

    由圖5可以看出,枸杞多糖得率隨著酶添加量的增加而增大;當(dāng)酶添加量為0.6%時(shí),枸杞多糖得率達(dá)到45.362%;當(dāng)酶添加量>0.6%時(shí),隨著酶添加量的增大而變得緩慢,可能因?yàn)榇藭r(shí)酶用量在底物質(zhì)量濃度一定時(shí)達(dá)到飽和。因此,選擇復(fù)合酶添加量為0.6%。

    2.3 提取枸杞多糖的最佳工藝確定

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)料液比、浸提時(shí)間、提取溫度、復(fù)合酶添加量進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2,方差分析見(jiàn)表3。

    表2 枸杞多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for polysaccharide from Lycium barbarum extraction conditions optimization

    表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

    由表2可知,各因素影響枸杞多糖得率得主次關(guān)系順序?yàn)樘崛囟龋˙)>料液比(A)>復(fù)合酶添加量(D)>超聲時(shí)間(C)。最佳工藝條件為A2B1C2D1,即料液比為1∶40(g∶mL),提取溫度50 ℃,超聲時(shí)間50 min,復(fù)合酶添加量0.5%。并在此最優(yōu)提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),枸杞多糖得率達(dá)到58.910%,高于正交試驗(yàn)表中最大多糖得率52.372%,故可以認(rèn)為該組合為超聲波輔助熱水浸提法提取枸杞多糖的最佳提取工藝。由表3可知,各因素對(duì)結(jié)果影響均不顯著。

    3 結(jié)論

    單因素試驗(yàn)結(jié)果表明,寧夏枸杞多糖的提取受料液比,提取溫度,超聲時(shí)間,復(fù)合酶添加量4個(gè)因素影響較大,且各因素水平數(shù)據(jù)之間存在一定的梯度差。正交試驗(yàn)結(jié)果表明,枸杞多糖最佳提取工藝條件為料液比1∶40(g∶mL),浸提溫度50 ℃,超聲時(shí)間50 min,復(fù)合酶添加量0.5%。在此最佳條件下,枸杞多糖平均得率為58.910%。

    利用超聲輔助復(fù)合酶法提取枸杞多糖具有節(jié)約時(shí)間、能耗低、提取效率高等優(yōu)點(diǎn),可為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)枸杞多糖提供理論依據(jù)。

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