靈芝多糖的超聲輔助堿提工藝優(yōu)化

王 鋒，羅麗蘭，張秀清*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

靈芝（Ganoderma lucidum）是食藥兩用真菌，在中國(guó)被稱為“仙草”，大量的藥理學(xué)研究與臨床實(shí)踐進(jìn)一步證實(shí)靈芝的具有重要的藥理作用。靈芝多糖作為靈芝的主要成分之一，研究表明其具有抗腫瘤[1-4]、免疫調(diào)節(jié)[5-7]、抗氧化抗衰老[8-10]及降血糖血脂[11]等生物活性。

靈芝多糖有多種提取方式，包括水提醇沉法、堿提法、酶法、超聲及微波輔助提取法等[12-15]。傳統(tǒng)的方法是用熱水浸提法，該方法雖然操作簡(jiǎn)單，但是多糖的提取效率和生產(chǎn)效率都比較低；另一種應(yīng)用較多的靈芝多糖提取方法是堿提法，許多研究結(jié)果表明，堿提法與水提法比較，能夠極大的提高靈芝多糖得率[16]。超聲提取法作為一種輔助手段經(jīng)常被應(yīng)用到溶劑提取法中增加提取效果，大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，若在提取過(guò)程中加入超聲進(jìn)行輔助，可以極大的提高靈芝多糖的產(chǎn)率[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)的目的是得到一種能夠顯著提高靈芝多糖提取率的提取方法，對(duì)超聲輔助堿提靈芝多糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并將該工藝應(yīng)用到靈芝子實(shí)體多糖的提取中，與傳統(tǒng)水提法結(jié)果進(jìn)行比較，以確定該方法的高效性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝菌種：采自四川、安徽、東北、浙江四個(gè)地區(qū)；無(wú)水乙醇、苯酚、濃硫酸等（分析純）：北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ3200DE 數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TU-1901 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器廠；TG 16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；PB-10酸度計(jì)：德國(guó)Sartourius公司。

1.3 方法

1.3.1 靈芝多糖超聲輔助堿提工藝優(yōu)化

（1）靈芝多糖超聲輔助堿提工藝流程

靈芝菌絲體→粉碎→過(guò)60目篩→加入5%的NaOH溶液→超聲提取→熱水浴浸提→離心分離（4 000 r/min、15 min）→取上清液，調(diào)節(jié)pH值至7左右（6.8～7.2）→加入4倍體積無(wú)水乙醇→4 ℃中保存過(guò)夜→離心（4 000 r/min、15 min）→棄去上清液→沉淀?yè)]發(fā)干燥→復(fù)溶于水→定容→多糖提取液

（2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品多糖含量的測(cè)定

采用苯酚硫酸法進(jìn)行測(cè)定[19]，標(biāo)曲繪制方法：準(zhǔn)確稱取105 ℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖1.000 g，用蒸餾水定容至100 mL，取出1 mL該溶液定容至100 mL，配成0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別置于比色管中，各加蒸餾水使體積為2.0 mL。再各加入6%的苯酚1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL。靜置10 min后，搖勻，待反應(yīng)液完全冷卻后，于波長(zhǎng)490 nm條件下測(cè)定其吸光度值，以蒸餾水作為空白。

準(zhǔn)確吸取靈芝多糖提取液1 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法操作。以空白試劑作參比，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中多糖含量。多糖含量按如下公式計(jì)算：

式中：w為多糖含量，mg/g；m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的樣品測(cè)定液的葡萄糖含量，mg；V1為樣品定容體積，mL；m2為樣品的質(zhì)量，g；V2為比色時(shí)所移取樣品測(cè)定液的體積，mL。

（3）靈芝多糖超聲輔助堿提工藝的單因素試驗(yàn)

對(duì)堿提靈芝多糖過(guò)程中料液比、超聲時(shí)間、超聲功率、水浴熱提溫度、水浴熱提時(shí)間5個(gè)因素進(jìn)行單因素設(shè)計(jì)。料液比選擇1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL）；超聲功率選擇60 W、75 W、90 W、105 W、120 W、135 W、150 W；超聲時(shí)間選擇10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min；水浴熱提取溫度選擇40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃；水浴熱提時(shí)間選擇40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min。分別考察料液比、超聲時(shí)間、超聲功率、水浴熱提溫度、水浴熱提時(shí)間對(duì)多糖含量的影響。

（4）靈芝多糖超聲輔助堿提工藝的正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)料液比、超聲功率、超聲時(shí)間、水浴提取溫度和水浴提取時(shí)間這5個(gè)因素分別選擇4個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for polysaccharides extraction technology optimization

1.3.2 靈芝多糖傳統(tǒng)熱水提取工藝

參照文獻(xiàn)[20]的方法，對(duì)其稍作修改：稱取0.5 g粉碎后過(guò)60目篩的樣品粉末置于50 mL具塞離心管內(nèi)，用5 mL水浸潤(rùn)樣品，緩慢加入20 mL無(wú)水乙醇，混勻后將樣品置于超聲提取器中（90 W）提取30 min后，4 000 r/min離心10 min，棄去上清，不溶物用10 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇洗滌離心，用水將上述不溶物轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，加入50 mL 蒸餾水，裝上磨口的空氣冷凝管，于沸水浴中提取2 h后冷卻至室溫，過(guò)濾，將上清移至100 mL容量瓶中，洗滌殘?jiān)?～3次，用蒸餾水水定容。

1.3.3 靈芝多糖超聲輔助堿提優(yōu)化工藝的應(yīng)用

對(duì)四川、安徽、東北和浙江4個(gè)產(chǎn)地的靈芝子實(shí)體多糖分別利用1.3.1中得到的優(yōu)化工藝和1.3.2的傳統(tǒng)水提方法進(jìn)行提取，比較兩種工藝對(duì)靈芝子實(shí)體多糖提取率的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以多糖含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5.506 6x-0.022 6，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 7，表明二者線性關(guān)系良好。

2.2 料液比對(duì)多糖提取的影響

圖2 料液比對(duì)多糖含量的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharides content

由圖2可知，不同的料液比對(duì)靈芝多糖的含量之間存在顯著性差異。多糖提取率隨料液比的增加而上升，料液比為1∶50（g∶mL）時(shí)多糖含量達(dá)到最高，為67.5 mg/g，之后多糖的提取率趨于穩(wěn)定。由此可得出料液比為1∶50（g∶mL）時(shí)，多糖含量最高。

2.3 超聲功率對(duì)多糖提取的影響

圖3 超聲功率對(duì)多糖含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on polysaccharides content

由圖3可知，堿提取靈芝菌絲體多糖含量隨著超聲功率的上升呈現(xiàn)波浪形的趨勢(shì)，不同的超聲功率所得到的多糖含量差異不顯著。在超聲功率為120 W時(shí)，多糖含量最大，為64.0 mg/g。由此可得，超聲功率120 W時(shí)對(duì)靈芝多糖的提取效果最佳。

2.4 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取的影響

圖4 超聲時(shí)間對(duì)多糖含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on polysaccharides content

由圖4可知，超聲時(shí)間對(duì)堿提取靈芝菌絲體多糖的影響不明顯，提取時(shí)間為20 min時(shí)，多糖含量最大，為61.7 mg/g。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，靈芝菌絲體多糖含量有所下降。由此可得，超聲時(shí)間20 min對(duì)靈芝多糖的提取效果最佳。

2.5 水浴熱提取溫度對(duì)多糖提取的影響

由圖5可知，靈芝菌絲體多糖提取量隨水浴溫度的上升而上升，水浴提取溫度對(duì)靈芝菌絲體多糖的影響程度較大。提取溫度為100 ℃時(shí)多糖提取量達(dá)到最大值63.5 mg/g。因此，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，可以選擇80 ℃提取靈芝菌絲體多糖。

圖5 提取溫度對(duì)多糖含量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on polysaccharides content

2.6 水浴熱提取時(shí)間對(duì)多糖提取的影響

圖6 提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響Fig.6 Effect of extraction time on polysaccharides content

由圖6可知，熱提取時(shí)間對(duì)堿提靈芝菌絲體多糖的影響較大，隨著提取時(shí)間的增加，靈芝菌絲體多糖的提取量上升。在水浴提取80 min時(shí)達(dá)到最大值，菌絲體多糖的提取量為60.5 mg/g，之后有所下降。由此可得，選擇水浴提取80 min提取靈芝菌絲體多糖為宜。

2.7 靈芝多糖超聲輔助堿提工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，各因素分別選擇4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表2可知，對(duì)靈芝菌絲體多糖提取的影響因素主次順序?yàn)镋＞D＞C＞B＞A，即熱提溫度＞熱提時(shí)間＞超聲時(shí)間＞超聲功率＞料液比，最優(yōu)靈芝菌絲體提取靈芝多糖的組合是A2B3C1D3E4，即料液比為1∶40（g∶mL），超聲功率105 W，超聲時(shí)間20 min，水浴溫度100 ℃，水浴提取時(shí)間80 min。在此最佳工藝條件下，多糖含量為67.8 mg/g。

由表3可知，影響超聲輔助堿提取靈芝多糖含量的5個(gè)因素中，熱提取時(shí)間和熱提取溫度影響極顯著，超聲時(shí)間和超聲功率影響顯著，料液比對(duì)其影響不顯著。

表2 多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for polysaccharides extraction technology optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

2.8 靈芝多糖超聲輔助堿提優(yōu)化工藝的應(yīng)用

由圖7可知，對(duì)于4個(gè)產(chǎn)地的靈芝子實(shí)體的多糖，采用優(yōu)化得到的靈芝多糖超聲輔助堿提工藝進(jìn)行提取，其多糖含量均＞60 mg/g，最高達(dá)90 mg/g以上；而采用傳統(tǒng)的熱水提取法，4個(gè)產(chǎn)地的樣品中多糖含量均在30～40 mg/g之間。因此，實(shí)驗(yàn)得到的超聲輔助堿提工藝能顯著提高多糖含量。

圖7 不同產(chǎn)地靈芝堿提與水提多糖含量對(duì)比Fig.7 Comparison of polysaccharides contents of Ganoderma lucidum from different regions by alkaline extraction and water extraction

3 結(jié)論

靈芝多糖作為一種具有多種生理活性的物質(zhì)，研究提高其提取率的方法具有重要的價(jià)值。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)超聲輔助堿提取靈芝多糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳的提取工藝為料液比為1∶40（g∶mL），超聲功率105 W，超聲時(shí)間20 min，水浴提取溫度100 ℃，水浴提取時(shí)間80 min，該工藝得到的多糖含量達(dá)到了67.8 mg/g。并確定水浴提取時(shí)間和水浴提取溫度為極顯著性因素，超聲時(shí)間和超聲功率為顯著性因素，料液比為不顯著因素。隨后將該工藝應(yīng)用到靈芝子實(shí)體多糖的提取中，對(duì)浙江、東北、四川以及安徽四個(gè)地區(qū)采集到的靈芝子實(shí)體中的多糖分別用堿提法和水提法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示該優(yōu)化工藝的多糖提取率是水提法的1.5～3.0倍。本試驗(yàn)得到的靈芝多糖超聲輔助堿提工藝能顯著提高靈芝多糖的提取率，對(duì)現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

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