響應(yīng)面法優(yōu)化蜂蜜酒發(fā)酵工藝

彭 濤，馬文錦，王貴春，金 紅，殷 欣，張 輝，白艷茗

（1.甘肅省輕工研究院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

蜂蜜酒有近3 000年的文化底蘊(yùn)，是貴族酒的一種。蜂蜜酒是以蜂蜜作為原料，經(jīng)過發(fā)酵得到的酒精飲料，不僅保留了天然蜂蜜營養(yǎng)成分和保健功能，而且提高了氨基酸，維生素、礦物質(zhì)等重要生理活性物質(zhì)的含量，有很好的營養(yǎng)保健功效[1-3]。

我國蜂蜜年產(chǎn)量約為43萬t，盡管產(chǎn)量大，但是對(duì)蜂蜜酒的研究起步較晚，生產(chǎn)規(guī)模小且生產(chǎn)廠家較少，生產(chǎn)工藝也比較落后，產(chǎn)量有限，滿足不了國內(nèi)外市場的大量需求，市場前景良好[4-6]。葡萄糖、果糖和蔗糖均為蜂蜜中的主要成分，可作為酵母所直接利用的發(fā)酵底物，本試驗(yàn)對(duì)蜂蜜酒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立一套成熟的蜂蜜酒發(fā)酵工藝，最終獲得品質(zhì)優(yōu)良的蜂蜜酒產(chǎn)品，以滿足人們對(duì)天然蜂蜜發(fā)酵產(chǎn)品的消費(fèi)需求，增加了蜂產(chǎn)品的種類，開拓蜂蜜產(chǎn)品消費(fèi)市場，同時(shí)也為蜂產(chǎn)品開辟了一條新的發(fā)展途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狼牙蜂蜜（糖度75°Bx）：購于陜西省寶雞市；釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；檸檬酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蛋白酶：蘇柯漢（濰坊）生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PYXDHS-50型恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；LDZF-50KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械有限公司；DK-98-I電子恒溫水浴鍋：余姚市東方電子儀器廠；WZ101手持糖度計(jì)：浙江托普儀器有限公司；PHS-2C型酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；AR2140型電子分析天平：奧豪斯國際貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蜂蜜酒加工工藝流程

1.3.2 發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化單因素試驗(yàn)

初始糖度的確定：以無菌水稀釋蜂蜜以達(dá)到相應(yīng)的糖度，設(shè)定糖度分別為5°Bx、15°Bx、25°Bx、35°Bx、45°Bx，根據(jù)蜂蜜酒的綜合評(píng)價(jià)，確定其最適發(fā)酵糖度[7]。

發(fā)酵液pH值的確定[8]：采用檸檬酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，分別調(diào)節(jié)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，根據(jù)蜂蜜酒的綜合評(píng)價(jià)，確定其最適發(fā)酵pH值。

發(fā)酵溫度的確定：設(shè)定發(fā)酵溫度為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃，根據(jù)蜂蜜酒的綜合評(píng)價(jià)，確定其最適發(fā)酵溫度。

1.3.3 Box-Behnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法優(yōu)化蜂蜜酒發(fā)酵工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，將處理好的蜂蜜汁進(jìn)行發(fā)酵，選取發(fā)酵液糖度、發(fā)酵pH值、發(fā)酵溫度3個(gè)因素，以產(chǎn)品綜合指標(biāo)（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 蜂蜜酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis for honey wine fermentation technology optimization

1.3.4 蜂蜜酒綜合評(píng)價(jià)方法

對(duì)蜂蜜酒的色澤、香氣、口感和后味等感官特性及產(chǎn)品指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，滿分100分，評(píng)分方法及依據(jù)綜合參考國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》、GB/T 5009.49—2008《發(fā)酵酒及其配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》、GB/T 4789.25—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)酒類檢驗(yàn)》[9-11]。綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蜜酒發(fā)酵初始糖度的確定

發(fā)酵液中糖度過高，一方面會(huì)阻遏乙醇產(chǎn)生途徑中乙醇脫氫酶的活性而抑制發(fā)酵，不利于酒精產(chǎn)物的積累；另一方面會(huì)造成高滲透壓環(huán)境而抑制酵母的生長[12]。發(fā)酵液糖度過小又會(huì)使酵母生長緩慢，并且糖分幾乎全為酵母生長所用，酒精發(fā)酵不能正常進(jìn)行，幾乎不能產(chǎn)生酒精。蜂蜜中含糖量極高，必須予以合理的稀釋，使發(fā)酵液的糖度達(dá)到合理的范圍才能既利于酵母的生長又利于發(fā)酵產(chǎn)物的積累。由圖1可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著糖度的增加，蜂蜜酒的綜合評(píng)分增加，隨后呈現(xiàn)下降趨勢。糖度為5°Bx時(shí)，所發(fā)酵蜂蜜酒酒香不足，口味酸澀，綜合指標(biāo)為60分；而糖度為25°Bx時(shí)，所發(fā)酵的蜂蜜酒清亮透明，酒味濃厚協(xié)調(diào)，甘甜爽口，蜂蜜酒品質(zhì)達(dá)到較理想狀態(tài)，綜合指標(biāo)為88分。糖度＞25°Bx時(shí)，影響酵母生長，導(dǎo)致成品風(fēng)味不足。因此選擇初始糖度25°Bx為宜。

2.2 蜂蜜酒發(fā)酵液pH值的確定

發(fā)酵液pH是影響酵母生長的重要因素，酸性或堿性過強(qiáng)都會(huì)抑制其生長，而酵母的生長情況是發(fā)酵工藝中的關(guān)鍵，直接影響產(chǎn)品品質(zhì)，因此，合理pH值的選取至關(guān)重要。由圖2可知，當(dāng)pH值為3.0時(shí)，蜂蜜酒渾濁、入口蜜甜、無酒香，綜合指標(biāo)63分；隨著pH值的增大，蜂蜜酒品質(zhì)發(fā)生顯著變化，當(dāng)pH值為5.0時(shí)，蜂蜜酒清亮透明、酒味濃厚、甘甜爽口、后味足，蜂蜜酒品質(zhì)達(dá)到較理想狀態(tài)，綜合指標(biāo)為86分。當(dāng)pH值＞5.0時(shí)，產(chǎn)品綜合指標(biāo)下降。因此選擇發(fā)酵pH 5.0為宜。

2.3 蜂蜜酒發(fā)酵溫度的確定

溫度對(duì)發(fā)酵起著決定性的作用，直接表現(xiàn)為糖的消耗，間接影響口感和芳香物質(zhì)的形成，溫度是發(fā)酵參數(shù)控制中的重中之重[13-15]。圖3為發(fā)酵溫度對(duì)蜂蜜酒綜合指標(biāo)的影響。由圖3可知，溫度過高或過低都會(huì)影響蜂蜜酒的發(fā)酵，降低產(chǎn)品品質(zhì)，當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，蜂蜜酒清亮透明，酒香濃郁，口味醇香，產(chǎn)品品質(zhì)達(dá)到較理想狀態(tài)，綜合指標(biāo)為84分。因此選擇發(fā)酵溫度25 ℃為宜。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)蜂蜜酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on honey wine quality

2.4 蜂蜜酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.4.1 Box-Behnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法優(yōu)化蜂蜜酒發(fā)酵工藝

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment

2.4.2 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert軟件對(duì)表3中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次線性回歸擬合，得到數(shù)學(xué)模型，并對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4，對(duì)各因素進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合后，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

表4 回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 4 Results of regression statistical analysis

由表4可知，模型極顯著（P＜0.000 1），因變量與所考察自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.982 2），表明所建立的模型可以用來解釋98.22%的響應(yīng)變化，模型調(diào)整確定系數(shù)0.959 3，說明該模型能解釋95.93%響應(yīng)值的變化，只有4.07%的總變異沒有包括其中，擬合程度較好，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.01），說明本試驗(yàn)所得二次回歸方程高度顯著，能夠很好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測。二次項(xiàng)A2與C2影響極顯著，B2影響顯著，而發(fā)酵液糖度影響最大，且所考察因素對(duì)響應(yīng)值影響不是簡單的一次線性關(guān)系。

2.4.3 蜂蜜酒發(fā)酵響應(yīng)面分析及優(yōu)化

通過Design-Expert軟件分析，得到響應(yīng)面及等高線圖（見圖4），可直觀反映各因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，其中等高線的形狀可反映出交互效益的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素之間交互作用顯著，圓形則與之相反。

利用Design-Expert軟件分析得到最優(yōu)發(fā)酵條件，當(dāng)糖度為25.06°Bx、發(fā)酵溫度為24.60 ℃、pH值為5.00時(shí)，蜂蜜酒綜合指標(biāo)為86.1分，即各因素選取最優(yōu)值后所得最大響應(yīng)值?？紤]到實(shí)際操作性，設(shè)定糖度為25°Bx、發(fā)酵溫度為25 ℃、pH值為5.0。對(duì)以上最優(yōu)工藝進(jìn)行5批驗(yàn)證試驗(yàn)，綜合指標(biāo)平均值為86.7分，表明預(yù)測值與試驗(yàn)平均值結(jié)果基本一致，故確定蜂蜜酒發(fā)酵最優(yōu)工藝：糖度為25 °Bx、發(fā)酵溫度為25 ℃、pH值為5.0。

圖4 初始糖度、發(fā)酵pH值以及溫度交互作用對(duì)蜂蜜酒感官評(píng)分影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effect of interaction between initial sugar content,pH and temperature on sensory evaluation score of honey wine

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法確定了蜂蜜酒的最佳發(fā)酵工藝：發(fā)酵液初始糖度為25 °Bx、發(fā)酵溫度為25 ℃、發(fā)酵pH值為5.0。在此工藝條件下所釀造的蜂蜜酒綜合評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)為86.7分，品質(zhì)最佳，具有獨(dú)特的風(fēng)味。

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